猪Crabp2基因在调控猪卵泡颗粒细胞凋亡上的应用制造技术

本发明专利技术公开了猪Crabp2基因在调控猪卵泡颗粒细胞凋亡上的应用，本发明专利技术成功构建猪Crabp2过表达载体并通过转染猪卵泡颗粒细胞实现细胞内表达。发现Crabp2过表达可降低猪卵泡颗粒细胞的凋亡率，促进颗粒细胞凋亡相关基因Bcl‑2的表达，抑制Bax、Caspase‑3、Fas和FasL的表达，进而在猪卵泡颗粒细胞中发挥抗凋亡的调控作用。

【技术实现步骤摘要】
猪Crabp2基因在调控猪卵泡颗粒细胞凋亡上的应用
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种猪Crabp2基因在猪卵泡颗粒细胞中抗凋亡的用途。
技术介绍
在哺乳动物卵巢中，每个生殖周期只有少数卵泡最终成熟并排卵，超过99％的卵泡都经历了一种称作闭锁的退化过程，卵泡闭锁是哺乳动物卵巢卵泡生长和发育的阴性选择过程。目前研究已经表明，卵巢颗粒细胞凋亡在卵泡闭锁过程中发挥主要作用。正常生长发育的卵泡内只有很少的凋亡的颗粒细胞，当正常晚期卵泡内颗粒细胞凋亡率达10％以上时卵母细胞就会被诱导凋亡，卵泡随即发生闭锁，因此颗粒细胞的凋亡也被看作是卵泡闭锁的主要原因之一。相关研究表明，全反式视黄酸(All-transretinoicacid,ATRA)对卵泡发育过程中颗粒细胞的功能起到重要的调控作用。细胞质视黄酸结合蛋白(Cytoplasmretinoicacidbindingproteins,Crabps)可结合ATRA。虽然该蛋白质功能的重要性尚未被完全了解，但它可能发挥向核受体递送配体从而增强ATRA的生物学作用。Crabps(约16-17kDa)是一种与ATRA有高亲和性的蛋白，属于细胞内脂质结合蛋白(Lipidbindingprotein,ILBP)多基因家族。其中Crabp2是Crabps蛋白家族中的重要成员。Crabp2在细胞质和细胞核均有表达。鉴于它的表达特点及与ATRA的高亲和力和特异性，Crabp2被认为是细胞中传递ATRA信号的信使。已有研究表明，Crabp2可能参与将ATRA转运到细胞核，参与视黄酸受体的激活和ATRA依赖性基因的调节。猪Crabp2基因位于猪4号染色体上，编码138个氨基酸，与人、鼠的同源性分别为95％、92％，主要在脑和脂肪中高表达，其次是肺脏、骨骼肌和肾脏，在心脏和大肠中表达最低。前期研究发现Crabp2可参与多种细胞凋亡的调控，例如敲低Crabp2可诱导人恶性外周神经鞘瘤细胞的凋亡；过表达Crabp2可促进人子宫内膜细胞的凋亡；Crabp2沉默可促进成纤维样滑膜细胞的凋亡。但至今还未见有关于Crabp2对猪卵泡颗粒细胞凋亡作用的报道。Bcl-2家族蛋白Bcl-2和Bax与Caspase家族蛋白Caspase-3都是细胞凋亡过程中重要的调控蛋白。其中Bax是决定细胞凋亡的重要蛋白，Caspase-3是细胞凋亡的执行者，二者被认为是促凋亡蛋白；而Bcl-2可通过抑制细胞Bax的表达进而抑制细胞凋亡，被认为是抗凋亡蛋白。相关研究表明，死亡受体家族凋亡通路在细胞凋亡中起关键作用，而Fas/FasL死亡受体通路被认为是最重要的介导细胞凋亡的通路。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题为：提供一种Crabp2的新的功能，调控猪卵泡颗粒细胞凋亡。本专利技术的技术方案为：猪Crabp2基因在调控猪卵泡颗粒细胞凋亡上的应用。进一步地，在猪卵泡颗粒细胞中过表达猪Crabp2基因，从而对猪卵泡颗粒细胞起到抗凋亡的作用。进一步地，在猪卵泡颗粒细胞中过表达猪Crabp2基因，从而促进Bcl-2的表达。进一步地，在猪卵泡颗粒细胞中过表达猪Crabp2基因，从而抑制Bax、Caspase-3、Fas和FasL的表达。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术成功构建猪Crabp2过表达载体并通过转染猪卵泡颗粒细胞实现细胞内表达。发现Crabp2过表达可降低猪卵泡颗粒细胞凋亡率，促进颗粒细胞凋亡相关基因Bcl-2的表达，抑制Bax、Caspase-3、Fas和FasL的表达，进而在猪卵泡颗粒细胞中发挥抗凋亡的调控作用。附图说明图1猪卵巢组织cDNAPCR产物的鉴定；M：DL2000DNAMarker；1、2：猪卵巢组织cDNAPCR产物。图2Crabp2基因的扩增测序比对结果，Query：测序目的序列；Sbject：Genbank参考序列。图3重组表达载体双酶切鉴定图，A：pGEM-T-Crabp2双酶切凝胶电泳图，M：DL2000DNAMarker，1、2：pcDNA3.1-Crabp2的酶切产物；B：pcDNA3.1-Crabp2双酶切凝胶电泳图，M：DL2000DNAMarker，1、2：pcDNA3.1-Crabp2的酶切产物。图4Crabp2过表达载体酶切产物测序结果图。图5荧光显微镜观察猪卵泡颗粒细胞FSHR表达情况，A：FSHR抗体免疫的颗粒细胞(100×)；B：FSHR抗体阴性对照的颗粒细胞(100×)。图6Crabp2过表达对猪卵泡颗粒细胞Crabp2表达的影响，A：Crabp2过表达载体转染24h后颗粒细胞Crabp2mRNA表达变化；B：Crabp2过表达载体转染48h后颗粒细胞Crabp2mRNA表达变化；C：Crabp2过表达载体转染颗粒细胞Crabp2蛋白表达变化。*表示0.01<P<0.05为差异显著，**表示P<0.01为差异极显著。图7Crabp2过表达对猪卵泡颗粒细胞凋亡率的影响，A：转染pcDNA3.1(+)空载体质粒的颗粒细胞检测结果；B：转染pcDNA3.1-Crabp2质粒的颗粒细胞检测结果；C：颗粒细胞凋亡率的变化。*表示0.01<P<0.05为差异显著，**表示P<0.01为差异极显著。图8Crabp2过表达对猪卵泡颗粒细胞凋亡相关基因表达的影响，A：Crabp2过表达载体转染24h后颗粒细胞凋亡相关基因表达变化；B：Crabp2过表达载体转染48h后颗粒细胞凋亡相关基因表达变化。*表示0.01<P<0.05为差异显著，**表示P<0.01为差异极显著。具体实施方式下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。1材料与方法1.1材料卵巢来源：成年猪卵巢采集自湖南省长沙市红星盛业食品股份有限公司屠宰场。试剂、培养基：pcDNA3.1(+)真核表达载体(Invitrogen，美国)；pGEM-T质粒载体(Promega，美国)；T4DNA连接酶和反转录酶M-MLV(Promega)；LA酶、限制性内切酶HindⅢ和EcolⅠ、DL2000Marker(TaKaRa，日本)；琼脂糖凝胶回收试剂盒(Omega)；无内毒素质粒提取试剂盒、感受态细胞DH5α(Tiangen)；AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒(碧云天)；PrimeScriptTMRTreagentKit、PremixExTaqTM(TaKaRa，日本)；RIPA细胞裂解液(碧云天)；蛋白定量测定试剂盒(南京建成)；DME/F-12培养基(Hyclone，美国)。1.2方法1.2.1引物设计与合成根据NCBIGenBank中报道的猪Crabp2基因的mRNA序列，利用PrimerPremier5在基因的编码区内设计特异性上、下游引物。Crabp2基因过表达上游引物:5′-AA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.猪Crabp2基因在调控猪卵泡颗粒细胞凋亡上的应用。/n

【技术特征摘要】
1.猪Crabp2基因在调控猪卵泡颗粒细胞凋亡上的应用。


2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在猪卵泡颗粒细胞中过表达猪Crabp2基因，从而对猪卵泡颗粒细胞起到抗凋亡的作用。


3.根据权利要求1所述的应...

【专利技术属性】
技术研发人员：张虹亮，包俐，吴夏梦，王英，李沐馨，王水莲，
申请(专利权)人：湖南农业大学，
类型：发明
国别省市：湖南;43