本发明专利技术涉及经修饰的7β‑羟基甾体脱氢酶(7β‑HSDH)。具体而言，与其起始7β‑HSDH相比，本发明专利技术的经修饰的7β‑HSDH具有改进的催化催化7‑酮‑石胆酸或其衍生物还原生产熊去氧胆酸或其衍生物的活性。本发明专利技术还涉及编码本发明专利技术的经修饰的7β‑HSDH的多核苷酸、表达本发明专利技术的经修饰的7β‑HSDH的载体和宿主细胞以及使用本发明专利技术的经修饰的7β‑HSDH和宿主细胞生产熊去氧胆酸及其衍生物的方法。
【技术实现步骤摘要】
经修饰的7β-羟基甾体脱氢酶及其应用
本专利技术涉及酶工程领域。具体而言，本专利技术涉及经修饰的7β-羟基甾体脱氢酶(7β-HSDH)及其在生产熊去氧胆酸或其衍生物中的应用。
技术介绍
熊去氧胆酸(UDCA)是名贵中药熊胆所含的主要有效成分，为甾体化合物，化学名为3α,7β-二羟基-5β-胆甾烷-24-酸，是一种胆酸类似物，有利胆作用。在临床上用于治疗胆结石、胆汁淤积性肝病、脂肪肝、各型肝炎、中毒性肝障碍、胆囊炎、胆道炎和胆汁性消化不良、胆汁返流性胃炎、眼部疾病等。UDCA可以从人工养殖的熊的胆中获得，但是收率低，来源有限，而且有动物保护问题。因此，人工合成UDCA具有重要意义。UDCA的合成方法主要有全化学合成和化学-酶促合成的方法，起始原料为动物来源的胆酸(CA)或去氧胆酸(如CDCA)。UDCA的经典化学合成方法包括如式I所示的步骤。其中，7-酮-石胆酸(7-keto-LCA)的还原需要使用金属钠或者Pd/C催化氢化，选择性低，工业化放大生产不容易控制且不安全。研究表明，可以用7β-羟基甾体脱氢酶(7β-HSDH)催化式I的反应，并且反应选择性高，不会形成副产物。但是，本领域仍然需要提供具有提高的催化7-酮-石胆酸或其衍生物还原为UDCA或其衍生物的酶活性的7β-HSDH。
技术实现思路
在第一方面，本专利技术提供一种经修饰的7β-羟基甾体脱氢酶(7β-HSDH)，与其起始7β-HSDH相比，包含一或多个位置的氨基酸取代，并且具有改进的催化7-酮-石胆酸或其衍生物还原生产熊去氧胆酸或其衍生物的活性。在一些实施方案中，所述经修饰的7β-HSDH包含位置203的氨基酸取代，优选取代为F、Y或L，所述且参照SEQIDNO:1进行编号。在一些实施方案中，所述经修饰的7β-HSDH还包含选自位置4、18、44、55、64、102、128、196和238的一或多个位置的取代。优选地，位置4取代为S。优选地，位置18取代为D。优选地，位置44取代为R。优选地，位置55取代为T。优选地，位置64取代为R。优选地，位置102取代为E。优选地，位置128取代为H。优选地，位置196取代为N。优选地，位置238取代为R。在一些实施方案中，所述经修饰的7β-HSDH包含位置55和203的氨基酸取代，其中位置55取代为T，且位置203取代为F或Y。在一些实施方案中，所述经修饰的7β-HSDH包含位置64和203的氨基酸取代，其中位置64取代为R，且位置203取代为F或Y。在一些实施方案中，所述经修饰的7β-HSDH包含位置55、64和203的氨基酸取代，其中位置55取代为T，位置64取代为R，且位置203取代为F或Y。在一些实施方案中，所述起始7β-HSDH包含SEQIDNO:1的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述经修饰的7β-HSDH包含SEQIDNO:2-9、11、12、14、15和17-29之一的氨基酸序列。在第二方面，本专利技术提供编码本专利技术的经修饰的7β-HSDH的多核苷酸，以及包含本专利技术的多核苷酸的载体。在第三方面，本专利技术提供包含本专利技术的的经修饰的7β-HSDH、其编码多核苷酸或包含所述多核苷酸的载体的宿主细胞。在第四方面，本专利技术还提供一种生产熊去氧胆酸或其衍生物的方法，包括使本专利技术的经修饰的7β-HSDH或本专利技术的宿主细胞与7-酮-石胆酸或其衍生物接触。专利技术详述现在将详细参考本专利技术的某些实施方案，其示例在所附的结构和反应式中示出。尽管将结合所列举的实施方案描述本专利技术，但是应当理解，它们并不旨在将本专利技术限制于那些实施方案。相反，本专利技术旨在覆盖可包括在如权利要求所限定的本专利技术的范围内的所有替代、修改和等同形式。本领域技术人员将认识到许多与本文描述的方法或材料相似或等同的方法和材料可用于实施本专利技术。本专利技术不限于所描述的方法和材料。如果所引用的文献、专利和类似材料中的一个或多个与本申请不同或相矛盾，包括但不限于所定义的术语、术语用法、所描述的技术等，则以本申请为准。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本专利技术所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管下面描述了合适的方法和材料，但是与本文描述的那些类似或等同的方法和材料可以用于本专利技术的实践或测试中。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用整体并入本文。除非另有说明，否则本申请中使用的命名基于IUPAC系统命名。一、经修饰的7β-羟基甾体脱氢酶如本文所用，“7β-羟基甾体脱氢酶”和“7β-HSDH”具有催化7-酮-石胆酸或其衍生物还原生成熊去氧胆酸或其衍生物的活性。本专利技术提供经修饰的7β-HSDH多肽，与其起始7β-HSDH多肽相比，所述经修饰的7β-HSDH具有改进的催化7-酮-石胆酸或其衍生物还原生成熊去氧胆酸或其衍生物的活性。如本文所用，术语“肽”表示通过肽键连接的至少两个氨基酸的链。术语“多肽”在本文中可以与术语“蛋白质”互换使用，是指含有十个或更多个氨基酸残基的链。本文中的所有肽和多肽化学式或序列均是从左至右书写的，表示从氨基末端至羧基末端的方向。术语“氨基酸”包括蛋白质中天然存在的氨基酸和非天然氨基酸。蛋白质中天然存在的氨基酸的单字母和三字母命名采用本领域惯用名，可见于Sambrook,etal.(MolecularCloning:ALaboratoryManual,2nd,ed.ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.,1989)。如本文所用，术语“修饰”是指对多肽的任何修饰，例如氨基酸的取代、缺失、插入和/或添加。在一些实施方案中，本专利技术的经修饰的7β-HSDH与其起始7β-HSDH相比，包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个氨基酸取代，其中本专利技术的经修饰的7β-HSDH与其起始7β-HSDH相比，具有改进的催化7-酮-石胆酸或其衍生物还原生成熊去氧胆酸或其衍生物的活性。在一些实施方案中，所述经修饰的7β-HSDH与其起始7β-HSDH相比，包含1-20、1-15、1-14、1-13、1-12、1-11、1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3或1-2个氨基酸取代，其中本专利技术的经修饰的7β-HSDH与其起始7β-HSDH相比，具有改进的催化7-酮-石胆酸或其衍生物还原生成熊去氧胆酸或其衍生物的活性。在一些实施方案中，本专利技术的经修饰的7β-HSDH与其起始7β-HSDH相比，包含位置203的氨基酸取代，所述位置参照SEQIDNO:1进行编号，优选取代为F、Y或L。在一些实施方案中，本专利技术的经修饰的7β-HSDH还包含选自位置4、18、44、55、64、102、128、196和238的一或多个位置的氨基酸取代。优选地，位置4取代为S。优选地，位置18取代为D。优本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种经修饰的7β-羟基甾体脱氢酶(7β-HSDH)，/n与其起始7β-HSDH相比，包含位置203的氨基酸取代，所述位置203的氨基酸取代为F、Y或L，且任选地，所述经修饰的7β-HSDH还包含选自位置4、18、44、55、64、102、128、196和238的一或多个位置的取代，其中氨基酸位置参照SEQ ID NO:1进行编号，/n其中与其起始7β-HSDH相比，所述经修饰的7β-HSDH具有改进的催化7-酮-石胆酸或其衍生物还原生成熊去氧胆酸或其衍生物的活性。/n
【技术特征摘要】
1.一种经修饰的7β-羟基甾体脱氢酶(7β-HSDH)，
与其起始7β-HSDH相比，包含位置203的氨基酸取代，所述位置203的氨基酸取代为F、Y或L，且任选地，所述经修饰的7β-HSDH还包含选自位置4、18、44、55、64、102、128、196和238的一或多个位置的取代，其中氨基酸位置参照SEQIDNO:1进行编号，
其中与其起始7β-HSDH相比，所述经修饰的7β-HSDH具有改进的催化7-酮-石胆酸或其衍生物还原生成熊去氧胆酸或其衍生物的活性。
2.权利要求1的经修饰的7β-HSDH，其包含选自以下的一或多个氨基酸取代：位置4取代为S，位置18取代为D，位置44取代为R，位置55取代为T，位置64取代为R，位置102取代为E，位置128取代为H，位置196取代为N和位置238取代为R。
3.权利要求1或2的经修饰的7β-HSDH，其中所述经修饰的7β-HSDH包含位置55和203的氨基酸取代，其中位置55取代为T，且位置203取代为F或Y。
4.权利要求1或2的经修饰的7β-HSDH，其中所述经修饰的7β-HSDH包含...
【专利技术属性】
技术研发人员：谢新开，杜好勉，
申请(专利权)人：苏州引航生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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