白星花金龟幼虫蛋白PB3及其分离方法和应用技术

本发明专利技术涉及农业生物技术领域，具体涉及白星花金龟幼虫蛋白PB3及其分离方法和应用。本发明专利技术优化了白星花金龟幼虫抗炎蛋白的最佳提取方法。抗炎蛋白SDS‑PAGE凝胶电泳后，按分子量大小选取超滤管将其分离成三个组分PB

【技术实现步骤摘要】
白星花金龟幼虫蛋白PB3及其分离方法和应用
本专利技术涉及农业生物
，具体涉及白星花金龟幼虫蛋白PB3及其分离方法和应用。
技术介绍
白星花金龟幼虫以秸秆、烂菜叶以及蘑菇菌糠为饲养原料，是非常有效的农业废弃物转化器。白星花金龟幼虫是一种传统的中药材，它有破瘀、散结、止痛、解毒等功效，可治疗破伤风、目中翳障、小儿丹毒等。借助现代医学以及检测分析手段分析可知，白星花金龟幼虫在抗细菌病毒、抗肿瘤和抗氧化衰老等方面具有显著作用。目前，国内外对白星花金龟幼虫的报道主要集中在饲养管理和防治技术这两个方面，对白星花金龟幼虫蛋白及其功效机理的研究鲜见。此外，动植物蛋白的分类提取在国内外研究较多，而且体系比较成熟，而昆虫蛋白的分类提取及分类后抗炎性的研究报道较为少见。因此，白星花金龟幼虫抗炎肽的开发利用具有重要的现实意义。实验探究了白星花金龟幼虫抗炎性蛋白的抗炎活性成分、抗炎作用效果和作用机制。为白星花金龟幼虫蛋白的提取、分离纯化提供了新方法，为白星花金龟幼虫抗炎蛋白的研究利用提供了新思路。为白星花金龟幼虫在临床天然药物、食物保健品治疗或缓解炎症症状等方面提供了可能的发展方向和科学依据。有利于白星花金龟这一新昆虫资源的充分开发和应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供白星花金龟幼虫蛋白PB3。本专利技术的再一目的是提供白星花金龟幼虫蛋白PB3的分离方法。本专利技术的再一目的试听上述白星花金龟幼虫蛋白PB3的应用。根据本专利技术的白星花金龟幼虫蛋白PB3，其通过包括以下步骤的方法分离而得称取脱脂白星花金龟幼虫样品，以1:5～1:15g/mL的比例加入0.5％～1.5％的NaOH溶液，pH在4～6，40℃～55℃恒温条件下，水浴搅拌0.5h～1.5h，离心取上清液，向上清液中加入酸至不再产生沉淀为止，分离沉淀，得白星花金龟幼虫蛋白粗分离蛋白；将上述白星花金龟幼虫蛋白粗分离蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳后，根据蛋白条带的大小选择50KD和10KD的超滤管，将幼虫蛋白按大小差异分离成三个不同组分：PB1、PB2、PB3，其中PB3分子量小于10KD。根据本专利技术的白星花金龟幼虫蛋白PB3，其中，称取脱脂白星花金龟幼虫样品，以1:15g/mL的比例加入1.5％的NaOH溶液，在pH4、55℃恒温条件下，水浴搅拌1.5h，离心取上清液，向上清液中加入酸至不再产生沉淀为止，分离沉淀，得白星花金龟幼虫蛋白粗分离蛋白。根据本专利技术的白星花金龟幼虫蛋白PB3，其中，进一步使用制备型色谱柱SephadexG-15来分馏白星花金龟幼虫抗炎性蛋白分离组分，用超纯水配制浓度为20mg/mL的样品溶液，上样量为2mL，柱温30℃，用0.1％三氟乙酸-水-乙腈系统，设置95％水和5％乙腈，设置流速15mL/min洗脱，在220nm下检测吸光值，分段收集馏分，分别为PB3-1(0-3min，0-0.1AU)、PB3-2(3-5min，0.1-2.9AU)、PB3-3(5-6.2min，2.9-6.3AU)、PB3-4(6.2-8.7min，6.3-0.1AU)、PB3-5(8.7-13min，0.1-0.0AU)、PB3-6(13-19min，0.0-0.0AU)。根据本专利技术的分离白星花金龟幼虫蛋白的方法包括以下步骤：称取脱脂白星花金龟幼虫样品，以1:5～1:15g/mL的比例加入0.5％～1.5％的NaOH溶液，pH在4～6，40℃～55℃恒温条件下，水浴搅拌0.5h～1.5h，离心取上清液，向上清液中加入酸至不再产生沉淀为止，分离沉淀，得白星花金龟幼虫蛋白粗分离蛋白；将上述白星花金龟幼虫蛋白粗分离蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳后，根据蛋白条带的大小选择50KD和10KD的超滤管，将幼虫蛋白按大小差异分离成三个不同组分：PB1、PB2、PB3，其中PB3分子量小于10KD。根据本专利技术的分离白星花金龟幼虫蛋白的方法，其中，称取脱脂白星花金龟幼虫样品，以1:15g/mL的比例加入1.5％的NaOH溶液，在pH4、55℃恒温条件下，水浴搅拌1.5h，离心取上清液，向上清液中加入酸至不再产生沉淀为止，分离沉淀，得白星花金龟幼虫蛋白粗分离蛋白。根据本专利技术的分离白星花金龟幼虫蛋白的方法，其中，进一步使用制备型色谱柱SephadexG-15来分馏白星花金龟幼虫抗炎性蛋白分离组分，用超纯水配制浓度为20mg/mL的样品溶液，上样量为2mL，柱温30℃，用0.1％三氟乙酸-水-乙腈系统，设置95％水和5％乙腈，设置流速15mL/min洗脱，在220nm下检测吸光值，分段收集馏分，分别为PB3-1(0-3min，0-0.1AU)、PB3-2(3-5min，0.1-2.9AU)、PB3-3(5-6.2min，2.9-6.3AU)、PB3-4(6.2-8.7min，6.3-0.1AU)、PB3-5(8.7-13min，0.1-0.0AU)、PB3-6(13-19min，0.0-0.0AU)。本专利技术还提供了上述白星花金龟幼虫蛋白用于制备抗炎制剂的应用。本专利技术优化了白星花金龟幼虫抗炎蛋白的最佳提取方法。抗炎蛋白SDS-PAGE凝胶电泳后，按分子量大小选取超滤管将其分离成三个组分PB1、PB2、PB3，检测发现组分PB3(＜10kDa)的抗炎作用效果最佳。采用高效液相色谱对PB3进一步分离纯化，色谱柱SephadexG-15凝胶过滤层析，得到六个不同的馏分PB3-1、PB3-2、PB3-3、PB3-4、PB3-5、PB3-6，分别检测抗炎活性。结果显示馏分PB3-4的抗炎作用最佳。研究了白星花金龟幼虫蛋白的抗炎活性成分及其抗炎效果和抗炎作用机制。结果表明，白星花金龟幼虫蛋白具有抗炎效果，且一定范围内抗炎蛋白对NO、TNF-α、IL-1β的抗炎作用效果呈浓度依赖性，当抗炎蛋白的质量浓度为15mg/mL时，抗炎作用效果最佳。抗炎蛋白的抗炎效果是通过抑制相关的炎症调节因子和促炎因子的表达来发挥作用的，并能够在基因水平上影响其分子信号的表达。附图说明图1显示CCK-8法检测实施例1不同方法提取的白星花金龟幼虫蛋白RAW264.7细胞存活率；图2显示实施例1不同方法提取的白星花金龟幼虫蛋白对NO含量的作用；图3显示实施例1不同方法提取的白星花金龟幼虫蛋白对IL-1β含量的作用；图4显示实施例1不同方法提取的白星花金龟幼虫蛋白对TNF-α含量的作用；图5显示实施例1不同方法提取的白星花金龟幼虫蛋白的抗炎性检测结果；图6显示NaOH浓度对蛋白抗炎性的影响；图7显示温度对蛋白抗炎性的影响；图8显示固液比对蛋白抗炎性的影响；图9显示提取时间对蛋白抗炎性的影响；图10显示提取pH对蛋白抗炎性的影响；图11显示优化的碱融法提取的幼虫蛋白对NO含量的抑制作用；图12显示优化的碱融法提取的幼虫蛋白对IL-1β含量的抑制作用；图13显示优化的碱融法提取的幼虫蛋白对TNF-α含量的抑制作用；图14显示优化的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.白星花金龟幼虫蛋白PB3，其特征在于，通过包括以下步骤的方法分离而得称取脱脂白星花金龟幼虫样品，以1:5～1:15g/mL的比例加入0.5％～1.5％的NaOH溶液，pH在4～6，40℃～55℃恒温条件下，水浴搅拌0.5h～1.5h，离心取上清液，向上清液中加入酸至不再产生沉淀为止，分离沉淀，得白星花金龟幼虫蛋白粗分离蛋白；/n将上述白星花金龟幼虫蛋白粗分离蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳后，根据蛋白条带的大小选择50KD和10KD的超滤管，将幼虫蛋白按大小差异分离成三个不同组分：PB

【技术特征摘要】
20200518 CN 20201041753201.白星花金龟幼虫蛋白PB3，其特征在于，通过包括以下步骤的方法分离而得称取脱脂白星花金龟幼虫样品，以1:5～1:15g/mL的比例加入0.5％～1.5％的NaOH溶液，pH在4～6，40℃～55℃恒温条件下，水浴搅拌0.5h～1.5h，离心取上清液，向上清液中加入酸至不再产生沉淀为止，分离沉淀，得白星花金龟幼虫蛋白粗分离蛋白；
将上述白星花金龟幼虫蛋白粗分离蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳后，根据蛋白条带的大小选择50KD和10KD的超滤管，将幼虫蛋白按大小差异分离成三个不同组分：PB1、PB2、PB3，其中PB3分子量小于10KD。


2.根据权利要求1所述的白星花金龟幼虫蛋白PB3，其特征在于，称取脱脂白星花金龟幼虫样品，以1:15g/mL的比例加入1.5％的NaOH溶液，在pH4、55℃恒温条件下，水浴搅拌1.5h，离心取上清液，向上清液中加入酸至不再产生沉淀为止，分离沉淀，得白星花金龟幼虫蛋白粗分离蛋白。


3.根据权利要求1所述的白星花金龟幼虫蛋白PB3，其特征在于，进一步使用制备型色谱柱SephadexG-15来分馏白星花金龟幼虫抗炎性蛋白分离组分，用超纯水配制浓度为20mg/mL的样品溶液，上样量为2mL，柱温30℃，用0.1％三氟乙酸-水-乙腈系统，设置95％水和5％乙腈，设置流速15mL/min洗脱，在220nm下检测吸光值，分段收集馏分，分别为0-3min、0-0.1AU峰值的馏分PB3-1，3-5min、0.1-2.9AU峰值的馏分PB3-2，5-6.2min、2.9-6.3AU峰值的馏分PB3-3，6.2-8.7min、6.3-0.1AU峰值的馏分PB3-4，8.7-13min、0.1-0.0AU峰值的馏分PB3-5，13-19min，0.0-0.0AU峰值的馏分PB3-6。
...

【专利技术属性】
技术研发人员：石冬冬，李秀梅，张海英，秦铭潞，满晨，
申请(专利权)人：中国农业科学院饲料研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11