芙蓉菊与阔叶毛华菊的属间远缘杂种创制方法技术

本发明专利技术公开了芙蓉菊与阔叶毛华菊的属间远缘杂种创制方法。所述方法包括：以菊科芙蓉菊属二倍体芙蓉菊为母本，菊科菊属六倍体阔叶毛华菊为父本，进行人工杂交。对幼胚进行离体培养，得到F1代植株。对F1代材料进行杂种形态学和细胞学鉴定，最终获得芙蓉菊和阔叶毛华菊的真杂种后代。本发明专利技术克服了芙蓉菊与阔叶毛华菊的属间远缘杂交障碍，获得了远缘杂种后代，创制了一批新种质。

【技术实现步骤摘要】
芙蓉菊与阔叶毛华菊的属间远缘杂种创制方法
本专利技术涉及植物育种领域，具体地说，涉及芙蓉菊与阔叶毛华菊的属间远缘杂种创制方法。
技术介绍
芙蓉菊(Crossostephiumchinense)，菊科芙蓉菊属单属单种，为我国特有，产于东南沿海地区。常绿亚灌木。叶常狭倒披针形，常全缘，两面密被灰色柔毛，质地厚；花径约0.5cm，淡黄色，无舌状花，花期11月下旬到翌年1月。芙蓉菊是少有的天然异色叶和芳香植物，又有耐盐碱、抗风及病虫害少等特性，所以广泛应用于园林。杨海燕(2016年)以8份广义菊属野生种为实验材料，对盐胁迫下生理指标的综合分析，证明芙蓉菊是一种优异的耐盐种质；林双冀(2017年)对盐胁迫下芙蓉菊和其它4种菊属植物的解剖结构及生理指标变化研究后，表明芙蓉菊具有独特的耐盐机理。国内关于芙蓉菊的研究主要集中在药用功能及耐盐机理方面，有关育种的研究甚少。阔叶毛华菊(Chrysanthemumvestitumvar.latifolium)，菊科菊属植物。散铺生长，具较少分枝。叶圆形、卵圆形，附厚绒毛，花序直径较大，约4.5-5.0cm。花白色，10月下旬开花，具有较好观赏性。钟剑等(2018年)对盐胁迫下阔叶毛华菊的形态及生理指标综合评价后发现其表现出中等耐盐性。菊花生产在我国呈区域化发展，沿海和北方地区的盐碱地限制了菊花的栽培推广。利用耐盐野生种质(如芙蓉菊)进行远缘杂交从而培育具有较强耐盐性的菊花品种是菊花育种的一个重要方向。胚拯救作为克服远缘杂交障碍的重要手段在菊属植物间已有所应用，但由于芙蓉菊无舌状花、未成熟胚小且难以剥离，相关技术在芙蓉菊属中的应用并不多。利用胚拯救技术获得的芙蓉菊和阔叶毛华菊的杂种后代，一方面继承了芙蓉菊的耐盐性状，可作为遗传材料用于细胞学和分子学研究，另一方面作为桥梁可以显著提高芙蓉菊属和菊属的杂交亲和性。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供芙蓉菊与阔叶毛华菊的属间远缘杂种创制方法。为了实现本专利技术目的，本专利技术提供了一种芙蓉菊与阔叶毛华菊的属间远缘杂种创制方法，其是以芙蓉菊属芙蓉菊与菊属阔叶毛华菊为亲本进行杂交，利用幼胚拯救技术获得远缘杂种。先前研究发现，芙蓉菊作为父本与阔叶毛华菊杂交时，其结实率为零。因此，本专利技术是以二倍体芙蓉菊为母本，六倍体阔叶毛华菊为父本进行杂交并通过胚拯救来创制远缘杂种。所述方法具体包括：1)亲本准备：对两亲本植株进行花期调控，使花期相遇；2)远缘杂交：当父母本均开花时，母本去雄，取父本新鲜花粉进行授粉并套袋；3)胚珠剥取：取杂交授粉后8-24天(优选授粉后18天)的头状花序(隔一天取一次)，消毒灭菌后取出胚珠；4)幼胚离体培养：将胚珠接种到不同激素配比的诱导培养基中进行培养，然后转入生根培养基中培养至出苗；5)杂种F1代的获得：待幼苗根长至1cm以上时，移植到基质中进行炼苗，之后上盆常规管理；6)真杂种的筛选：根据对亲本及杂种F1代的表型观察及细胞学鉴定，从F1代植株中筛选出真杂种。前述的方法，步骤1)包括：从8月份开始对母本芙蓉菊进行8-10小时的短日照养护，使其10月中旬达到盛花期。具体地，短日照养护条件为：湿度70-75％，白天温度24-28℃，晚上20-22℃，每天光照8-10小时，光照强度1600-2000lx。前述的方法，步骤3)包括：取杂交授粉后的头状花序，对其进行消毒灭菌，去掉子房壁，取出胚珠。优选地，消毒灭菌的方法包括：用70％-75％的酒精对头状花序表面消毒30-45秒，无菌水冲洗后，再用8％-13％的H2O2水溶液灭菌10-15分钟，然后无菌水冲洗。前述的方法，步骤4)中所述诱导培养基含有6-BA和NAA；所述生根培养基含有NAA。不同杂交组合胚培养，对培养基的要求不尽相同。在其它菊花近缘属植物杂交中，有文献报道使用MS+2.0mg/LKT+1.0mg/LIAA培养基可获得栽培菊花‘钟山金桂’和黄金艾蒿的杂交后代(陈发棣，2011)；也有文献报道使用MS+0.2mg/LIAA培养基可得到木茼蒿和蒿子秆的杂交后代，但发芽率仅为12.9％(HisaoOhtsuka，2008)。通过使用含6-BA和NAA的MS培养基进行芙蓉菊属间杂交后代胚培养进而获得愈伤组织及杂种幼苗的相关研究鲜见报道。所述诱导培养基为含有1.0-2.0mg/L6-BA和0.2-1.0mg/LNAA，pH5.6-5.8的MS培养基。优选地，所述诱导培养基为含有1.5mg/L6-BA和0.5mg/LNAA、pH5.6的MS培养基；含有2.0mg/L6-BA和0.2mg/LNAA、pH5.8的MS培养基；含有2.0mg/L6-BA和0.5mg/LNAA、pH5.8的MS培养基；含有2.0mg/L6-BA和1.0mg/LNAA、pH5.6的MS培养基；或含有1.0mg/L6-BA和0.5mg/LNAA、pH5.8的MS培养基。更优选地，所述诱导培养基为含有2.0mg/L6-BA和0.2mg/LNAA，pH5.8的MS培养基。所述生根培养基为：1/2MS+0.1mg/LNAA，pH5.6。前述的方法，步骤4)中进行诱导培养和生根培养的条件为：温度20-25℃(优选20℃)，每日光照14-16h，光照强度1600-2000lx(优选2000lx)；诱导培养4-6周后转为生根培养。前述的方法，步骤5)中所述基质由蛭石和珍珠岩按体积比1:1混合而成。炼苗的条件为：温度27-30℃，相对湿度60-70％，培养30-45天。前述的方法，步骤6)所述表型选自株高、冠幅、叶长、叶宽、叶柄长等中的至少一种。其中株高、冠幅、叶长、叶宽、叶柄长介于父母本之间的确定为真杂种。本专利技术中，对后代材料进行染色体减数分裂观察，染色体数目表现为四倍体的确定为真杂种。本专利技术中，母本选用芙蓉菊属二倍体芙蓉菊(Cr.chinense)，父本选用菊属六倍体阔叶毛华菊(C.vestitum)。借由上述技术方案，本专利技术至少具有下列优点及有益效果：(一)本专利技术选用耐盐种质芙蓉菊为母本，中等耐盐种质阔叶毛华菊为父本，可有效将耐盐基因引入菊花育种过程中。(二)本专利技术在组织培养技术上比较了不同胚胎发育时期、不同激素配比培养基下的胚发育效果。结果表明授粉后18天的幼胚培养效果最好，MS+2.0mg/L6-BA+0.2mg/LNAA，pH5.8的培养基最有利于胚发育，可达到6.25％的发芽率。(三)本专利技术利用形态学观察和细胞学鉴定对芙蓉菊与阔叶毛华菊的属间杂种真实性进行早期鉴定。(四)本专利技术可实现芙蓉菊和阔叶毛华菊杂交胚的继续发育，实现芙蓉菊和阔叶毛华菊的属间远缘杂交，从而获得杂种后代。(五)本专利技术使利用广义菊属菊花新种质进行菊花育种成为可能，同时有利于菊花起源演化及芙蓉菊属与菊属亲缘关系方面的深入研究。附图说明图1为本专利技术母本芙蓉菊(左)、父本阔叶毛华菊(中)、杂种后代(右)对比图。<本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.芙蓉菊与阔叶毛华菊的属间远缘杂种创制方法，其特征在于，以芙蓉菊属芙蓉菊与菊属阔叶毛华菊为亲本进行杂交，利用幼胚拯救技术获得远缘杂种。/n

【技术特征摘要】
1.芙蓉菊与阔叶毛华菊的属间远缘杂种创制方法，其特征在于，以芙蓉菊属芙蓉菊与菊属阔叶毛华菊为亲本进行杂交，利用幼胚拯救技术获得远缘杂种。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，以二倍体芙蓉菊为母本，六倍体阔叶毛华菊为父本进行远缘杂交。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，包括：
1)亲本准备：培养两亲本使花期相遇；
2)远缘杂交：当父母本均开花时，母本去雄，取父本新鲜花粉进行授粉并套袋；
3)胚珠剥取：取杂交授粉后8-24天的头状花序，取出胚珠；
4)幼胚离体培养：将胚珠接种到不同激素配比的诱导培养基中进行培养，然后转入生根培养基中培养至出苗；
5)杂种F1代的获得：待幼苗根长至1cm以上时，移植到基质中进行炼苗，之后上盆常规管理；
6)真杂种的筛选：根据对亲本及杂种F1代的表型观察，并结合细胞学倍性鉴定，从F1代植株中筛选出真杂种后代。


4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤1)包括：从8月份开始对母本芙蓉菊进行8-10小时的短日照养护，使其10月中旬达到盛花期。


5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤3)包括：取杂交授粉后的头状花序，对其进行消毒灭菌，去掉子房壁，取出胚珠；
优选地，取杂交授粉后18天的头状花序；
优选地，消毒灭菌的方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙明，郭彦宏，许婷，陈俊通，钟剑，李大伟，巴婷婷，常丽娜，张启翔，程堂仁，
申请(专利权)人：北京林业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11