一种用于2019-nCoV E基因检测的核酸组合物及其试剂盒与生产方法技术

本申请公开了一种用于2019‑nCoV E基因检测的核酸组合物及其试剂盒与生产方法，属于病毒体外核酸检测技术领域。本申请的用于检测2019‑nCoV E基因的核酸组合物，包括三组引物探针组合中的任意一组，每组引物探针组合均包括正向引物、反向引物和探针；本申请还提供了一种包括上述任意一组引物探针组合的检测试剂盒，试剂盒中还包括酶混合物和PCR MIX，该检测试剂盒可以制备成液态或粉态。本申请的核酸组合物和检测试剂盒可以对2019‑nCoV E基因中的目标基因进行特异性扩增，灵敏度高，降低了假性结果出现的几率，检测结果准确可靠。

A nucleic acid composition, kit and production method for 2019 ncov E gene detection

【技术实现步骤摘要】
一种用于2019-nCoVE基因检测的核酸组合物及其试剂盒与生产方法
本申请涉及病毒体外核酸检测
，特别涉及一种用于2019-nCoVE基因检测的核酸组合物及其试剂盒与生产方法。
技术介绍
2019年12月以来，陆续发现了多例不明原因肺炎病例，现已证实为一种新型冠状病毒感染引起的急性呼吸道传染病。2020年1月12日，世界卫生组织将引起本次病毒性肺炎病例的病原体命名为2019-nCoV，2020年2月11日被国际病毒分类委员会命名为SARS-CoV-2。2019-nCoV为RNA病毒，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60-140nm，具有极强的传染性，主要经呼吸道飞沫传播（喷嚏、咳嗽）和接触传染，主要引起人类呼吸系统感染，感染者常出现发热、乏力、干咳，逐渐出现呼吸困难等症状，多数患者预后良好，部分患者起病症状轻微，无明显发热，严重者出现急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒及凝血功能障碍等症状，病情危重者可导致死亡。2019-nCoV是第7个已报导可感染人的冠状病毒，其余6个分别为HCoV-229E、HCoV-OC43、SARS-CoV、HCoV-NL63，HCoV-HKU1及MERS-HCoV。其中HCoV-229E和HCoV-NL63属于α属冠状病毒，HCoV-OC43、SARS-CoV、HCoV-HKU1、MERS-CoV与2019-nCoV均为β属冠状病毒。核酸检测是临床病原学诊断的常用方法，具有灵敏高、特异性强等优点。新型冠状病毒肺炎疫情发生以来，核酸检测是临床诊断、解除隔离、康复出院的重要诊断依据。基于TaqMan探针法的实时荧光PCR技术具有简单、快速、准确的优势，已广泛应用于临床病原体的检测，在2003年我国爆发的SRAS病毒的疫情控制方面做出重要贡献，是WHO推荐的MERS-CoV病毒检测方法之一，目前实时荧光RT-PCR技术已被列入我国2019-nCoV诊疗指南。自疫情发生以来，国内外陆续涌现出了2019-nCoV核酸检测试剂盒，但是，从目前临床实际使用情况来看，现有的核酸检测试剂盒仍然存在假阴性的情况，会造成漏检，给疫情防控带来很大的隐患。其假阴性的原因可能是使用的引物序列都存在或多或少的引物区突变，特异性不高，从而无法特异性地扩增出目标基因，因此无法检测出样本中病毒的存在。鉴于此，目前仍需继续研发特异性高的核酸检测方案，以改善现有的核酸检测试剂盒存在的假阴性问题。
技术实现思路
针对现有的2019-nCoV核酸检测存在假阴性问题，本申请的目的是提供一种用于2019-nCoVE基因检测的核酸组合物，本申请的引物和探针组合能够特异性的扩增2019-nCoVE基因中的目标基因，且灵敏度高，从而能够准确的指示样品中2019-nCoV病毒的存在。本申请的第二个目的在于提供一种用于2019-nCoVE基因检测的试剂盒，本申请试剂盒较少的操作步骤可有效降低操作失误率，且检测时间短、检测效果准确可靠。本申请的第三个目的在于提供一种用于2019-nCoVE基因检测的试剂盒生产方法，本申请只需要将基因扩增所用试剂进行混合冻干便可生产获得2019-nCoV检测试剂盒，生产方法简单，适合大规模生产。为了实现上述第一个目的，本申请是通过以下技术方案得以实现的：一种用于2019-nCoVE基因检测的核酸组合物，包括三组引物探针组合中的任意一组，每组引物探针组合均包括正向引物、反向引物和探针；第一组正向引物的序列如SEQIDNO.1所示；第一组反向引物的序列如SEQIDNO.2所示；第一组探针的序列如SEQIDNO.3所示；第二组正向引物的序列如SEQIDNO.4所示；第二组反向引物的序列如SEQIDNO.5所示；第二组探针的序列如SEQIDNO.6所示；第三组正向引物的序列如SEQIDNO.7所示；第三组反向引物的序列如SEQIDNO.8所示；第三组探针的序列如SEQIDNO.9所示；所述三组引物探针组合中的探针5’端均采用荧光报告基团修饰，探针的3’端均采用荧光淬灭基团修饰。通过采用上述技术方案，本申请首先分析了2019-nCoV的病毒结构，其表现出典型的冠状病毒属结构：5’非翻译区(UTR)、复制酶复合体(orf1ab)、S基因、E基因、M基因、N基因、3’UTR，以及几个未识别的非结构开放阅读框。其中冠状病毒的小包膜蛋白E不但参与病毒的组装和出芽，而且在细胞膜上形成离子通道，并能激活炎症小体，促进炎症反应，是多功能病毒膜孔蛋白。由于E基因在病毒增殖中的重要性以及E基因的保守性，所以，本申请针对2019-nCoV的E基因进行引物和探针的设计和筛选。本申请从全球流感序列数据库(GISAID)（www.gisaid.org）下载了3295个全基因组序列，通过序列比对并与其他六种冠状病毒基因组数据分析比对，在新型冠状病毒的E基因上设计了三组引物探针组合，设计获得的引物探针组合与3295个全基因组序列完全匹配，无突变。而且每条序列与其他6种新冠病毒基因的一致性均低于80%；与其他呼吸道病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒序列一致性均低于60%。在NCBI数据库里，扩增引物对2019-nCoV病毒以外的物种无匹配结果。本申请的三组引物探针组合能够特异性的扩增2019-nCoVE基因上的目标基因，对其他物种、其他病毒，甚至是其他新冠病毒均无特异扩增，从而能够准确的检测出样品中的2019-nCoV病毒，降低实验结果假阴性的发生率，提高检测结果的准确性。为了实现上述第二个目的，本申请提供了一种用于2019-nCoVE基因检测的试剂盒，包括上述三组引物探针组合中的任意一组、酶混合物和PCRMIX。通过采用上述技术方案，本申请将引物探针组合以及酶混合物和PCRMIX制备成试剂盒的形式，一方面方便了2019-nCoV病毒的检测，缩短了检测时间，降低了检测操作的复杂性，降低操作失误率；另一方面试剂盒的形式便于检测试剂的储存、运输和销售，从而保证了试剂中有效成分的稳定性，进一步的保证了检测结果的准确性。进一步的，所述PCRMIX包括PCR缓冲液、阳离子及dNTPs。通过采用上述技术方案，本申请PCRMIX中的PCR缓冲液能够在PCR反应体系中起到缓冲作用，为酶混合物提供一个最适酶催化反应的条件，从而保证酶的有效性和高效性。本申请PCRMIX中的阳离子能够对PCR反应起到促进作用，加快PCR反应进程，缩短整个检测时间。本申请PCRMIX中的dNTP是聚合酶链式反应的原料，保证了PCR反应的正常进行。进一步的，所述PCR缓冲液为pH=8.3的Tris-HCl缓冲液。进一步的，所述阳离子包括K+和Mg2+。通过采用上述技术方案，本申请的K+能够促进引物退火，使引物与目的基因快速且特异性的配对，加速PCR反应进程。本申请的Mg2+作为热启动Taq酶β亚基的激活剂，能够与热启动Taq酶螯合，使热启动Taq酶发挥活性，另外，M本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于2019-nCoV E基因检测的核酸组合物，其特征在于：包括三组引物探针组合中的任意一组，每组引物探针组合均包括正向引物、反向引物和探针；/n第一组正向引物的序列如SEQ ID NO.1所示；/n第一组反向引物的序列如SEQ ID NO.2所示；/n第一组探针的序列如SEQ ID NO.3所示；/n第二组正向引物的序列如SEQ ID NO.4所示；/n第二组反向引物的序列如SEQ ID NO.5所示；/n第二组探针的序列如SEQ ID NO.6所示；/n第三组正向引物的序列如SEQ ID NO.7所示；/n第三组反向引物的序列如SEQ ID NO.8所示；/n第三组探针的序列如SEQ ID NO.9所示；/n所述三组引物探针组合中的探针5’端均采用荧光报告基团修饰，探针的3’端均采用荧光淬灭基团修饰。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于2019-nCoVE基因检测的核酸组合物，其特征在于：包括三组引物探针组合中的任意一组，每组引物探针组合均包括正向引物、反向引物和探针；
第一组正向引物的序列如SEQIDNO.1所示；
第一组反向引物的序列如SEQIDNO.2所示；
第一组探针的序列如SEQIDNO.3所示；
第二组正向引物的序列如SEQIDNO.4所示；
第二组反向引物的序列如SEQIDNO.5所示；
第二组探针的序列如SEQIDNO.6所示；
第三组正向引物的序列如SEQIDNO.7所示；
第三组反向引物的序列如SEQIDNO.8所示；
第三组探针的序列如SEQIDNO.9所示；
所述三组引物探针组合中的探针5’端均采用荧光报告基团修饰，探针的3’端均采用荧光淬灭基团修饰。


2.一种用于2019-nCoVE基因检测的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的三组引物探针组合中的任意一组、酶混合物和PCRMIX。


3.根据权利要求2所述的一种用于2019-nCoVE基因检测的试剂盒，其特征在于：所述PCRMIX包括PCR缓冲液、阳离子及dNTPs。


4.根据权利要求3所述的一种用于2019-nCoVE基因检测的试剂盒，其特征在于：所述PCR缓冲液为pH=8.3的Tris-HCl缓冲液。


5.根据权利要求3所述的一种用于2...

【专利技术属性】
技术研发人员：张树文，葛斌文，刘光明，孙娈燕，蒋明军，苏晓红，李黎明，
申请(专利权)人：南京黎明生物制品有限公司，中国医学科学院皮肤病医院中国医学科学院皮肤病研究所，
类型：发明
国别省市：江苏;32