臭柏SSR分子标记及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种臭柏SSR分子标记及其应用，该分子标记的编号为：JSSSR4、JSSSR5、JSSSR6、JSSSR15、JSSSR17、JSSSR20、JSSSR30、JSSSR31、JSSSR33、JSSSR35、JSSSR54、JSSSR57、JSSSR58、JSSSR61、JSSSR66、JSSSR74和JSSSR80，各编号所对应的臭柏SSR分子标记的引物对序列如SEQ ID NO.1‑34所示。本发明专利技术的17对臭柏SSR分子标记具有多态性丰富、扩增稳定、重复性好、便于统计等优点，能有效对臭柏种质资源进行遗传多样性分析及群体聚类分析，且能够在臭柏的近缘种中表现出良好的多态性和种间通用性。

SSR molecular marker of Sabina vulgaris and its application

【技术实现步骤摘要】
臭柏SSR分子标记及其应用
本专利技术涉及分子生物学DNA标记
，具体地，涉及一种基于GBS简化基因组测序开发的臭柏SSR分子标记及其应用。
技术介绍
臭柏(JuniperussabinaL.)又称叉子圆柏、沙地柏、新疆圆柏等，为柏科刺柏属常绿针叶灌木，间断分布于西班牙、哈萨克斯坦、中国、蒙古和俄罗斯。在中国天然分布于新疆天山至阿尔泰山、宁夏贺兰山、内蒙古毛乌素沙地和浑善达克沙地、青海东北部、甘肃祁连山以及陕西神木、榆林等地。臭柏根系发达，萌芽和萌蘖力强，抗旱、抗寒、抗风蚀等适应性强，枝条耐沙埋，是干旱、半干旱区防风固沙和水土保持的优良树种。同时，臭柏属于常绿树种，其枝条耐修剪，易于造型，可作北方城市园林绿化树种，与乔木搭配起到很好的的立体效果。臭柏还含有香桧醇、鬼臼毒素等化学成分，具有杀虫活性，亦可作为治疗风湿性关节炎等病症的药物。如臭柏的枝叶和果实具有祛风湿、活血止痛的效果，常用于治疗风湿性关节炎、类风湿性关节炎等，种子和枝叶可用以清热、健胃、消肿、利尿、活血与止痛等。臭柏的枝、茎干和果实中均含有挥发油，具有特殊浓郁气味，在化工上挥发油可作为调制化妆品、皂用香精的的原料。由于臭柏挥发油含量高，因此可以产生很好的经济效益。臭柏枝叶内富含多种养分，其中含粗蛋白6.14％；粗脂肪14.32％；粗纤维17.47％，是1种富含Ca、K、N元素的植物，而且所含氨基酸种类多，在沙区作为动物饲料将会很有发展前景。虽然臭柏具有重要的生态价值、药用价值、经济价值和饲料价值，但针对其遗传资源的研究却极少，仅有RAPD(RandomAmplifiedPolymorphic，随机扩增性DNA)标记和叶绿体基因片段等少量研究，标记手段单一局限，Geng等(2016)通过双重抑制PCR(suppression-PCR)技术开发了8对SSR(SimpleSequenceRepeat，简单重复序列)引物，但数量太少，覆盖的基因组位点不能满足臭柏遗传多样性分析的需求；曲娜等(2011)利用17条RAPD标记引物对臭柏4种变异类型的遗传多样性作了初步分析，但RAPD标记技术是显性标记，得到的信息量相对偏少，同时标记稳定性差，易受到设备、反应条件和操作手法的干扰，造成多态性差和谱带迁移难分辨的现象。此外，近年来，因臭柏生长环境恶化，天然更新困难，资源濒临灭绝，所以急需开发更多新的标记对臭柏资源进行更全面的遗传多样性评价，以提出相关保护策略。
技术实现思路
本专利技术所要解决的问题是提供一种臭柏SSR分子标记及其应用，旨在为臭柏的种质资源多样性分析、核心种质库的建立、构建指纹图谱、分子辅助育种以及臭柏资源开发利用和保护奠定基础。为了实现上述目的，本专利技术一方面提供一种臭柏SSR分子标记，该分子标记的编号为：JSSSR4、JSSSR5、JSSSR6、JSSSR15、JSSSR17、JSSSR20、JSSSR30、JSSSR31、JSSSR33、JSSSR35、JSSSR54、JSSSR57、JSSSR58、JSSSR61、JSSSR66、JSSSR74、JSSSR80，各编号所对应的臭柏SSR分子标记的引物对序列按顺序如SEQIDNO.1-34所示。本专利技术第二方面所要解决的技术问题是提供一种上述的臭柏SSR分子标记在臭柏遗传多样性分析中的应用。本专利技术第三方面所要解决的技术问题是提供一种上述的臭柏SSR分子标记在臭柏及其近缘种的群体聚类分析中的应用。通过上述技术方案，本专利技术实现了以下有益效果：1、本专利技术的17对臭柏SSR分子标记具有多态性丰富、扩增稳定、重复性好、便于统计等优点，能有效对臭柏种质资源进行遗传多样性分析及群体聚类分析，且能够在臭柏的近缘种(圆柏J.chinensis、杜松J.rigida)中扩增，表现出良好的多态性和种间通用性；2、基因组SSR分子标记技术扩增中，使用具有操作简便、高分辨率(可达到1bp)等优点的毛细管电泳检测法，相比之前相关研究利用非变性聚丙酰胺技术，毛细管电泳检测技术查看SSR基序变化更准确、更清晰。附图说明图1为臭柏用于GBS测序的10个群体采样地理位置示意；图2为供试臭柏及近缘种材料的UPGMA聚类图；图3为JSSSR17引物在部分臭柏材料中扩增得到的毛细管荧光电泳检测峰图，其中a、b、c和d分别表示材料DM8、GS30、HS34和NL16的扩增图谱；图4为JSSSR17引物在另一部分臭柏材料中扩增得到的毛细管荧光电泳检测峰图，其中e、f和g分别表示材料TL10、TL18和XM25的扩增图谱；图5为JSSSR17引物在杜松材料中扩增得到的毛细管荧光电泳检测峰图，其中a和b分别表示材料DS3和DS4的扩增图谱；图6为JSSSR17引物在圆柏材料中扩增得到的毛细管荧光电泳检测峰图，其中a、b、c和d分别表示材料YB1、YB2、YB4和YB5的扩增图谱。具体实施方式本专利技术提供了一种臭柏SSR分子标记，包括以下17对引物，引物对核苷酸序列信息及扩增目标片段大小见表1：表1臭柏17对SSR引物信息DNA分子标记中的SSR标记作为检测种内遗传多样性和种间遗传分化的最有效的标记手段，与其他微卫星标记相比，具有变异速率高，在基因组中分布均匀，数量庞大，多态性丰富，重复性好，呈共显性遗传等众多优点，在群体遗传学中应用最为广泛。随着测序技术的不断进步，SSR标记开发方式也从传统的酶切分离等方法转变为通过高通量测序方法获得基因组、转录组序列后开发的高效方式。其中GBS(GenotypingbySequencing)是基于限制性内切酶对目标基因组进行酶切，得到能充分代表全基因组信息序列的测序手段。较转录组获得的EST-SSR相比，GBS开发标记的基因组覆盖信息更广，更高效。基于以上技术，本专利技术的技术方案是：根据臭柏的GBS测序数据，设计基因组SSR引物，经过PCR扩增，毛细管荧光电泳检测筛选出17个具有多态性的基因组SSR分子标记。具体开发方法优选包括如下步骤：(1)GBS简化基因组数据来源臭柏GBS简化基因组数据来源于对臭柏天然群体叶片进行Illumina高通量深度测序的结果。用于测序的材料来自10个臭柏天然群体(具体见表2和图1)，每个群体选取10-15个个体采集叶片，共145份样品，液氮速冻，-80℃保存。测序时，每个个体采用双末端PE150测序策略构建1个文库，测序委托广州基迪奥生物科技有限公司采用IlluminaHiseq4000系统进行GBS测序(无参照)，对获得的原始下机数据(Rawdata)利用FastQC软件进行严格质量控制，过滤掉低质量的数据，得到高质量数据(Cleandata)用于后续的SSR引物开发。经过过滤，每个个体的Cleanreads(高质量可用读数)数量在22969032-55967724之间，其中过滤完的高质量reads(HQreads)均在90％以上。获得的GBSTag数量为442188条。表2臭柏GBS本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种臭柏SSR分子标记，其特征在于，所述分子标记的编号为：JSSSR4、JSSSR5、JSSSR6、JSSSR15、JSSSR17、JSSSR20、JSSSR30、JSSSR31、JSSSR33、JSSSR35、JSSSR54、JSSSR57、JSSSR58、JSSSR61、JSSSR66、JSSSR74和JSSSR80，各编号所对应的臭柏SSR分子标记的引物对序列按顺序如SEQ ID NO.1-34所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种臭柏SSR分子标记，其特征在于，所述分子标记的编号为：JSSSR4、JSSSR5、JSSSR6、JSSSR15、JSSSR17、JSSSR20、JSSSR30、JSSSR31、JSSSR33、JSSSR35、JSSSR54、JSSSR57、JSSSR58、JSSSR61、JSSSR66、JSSSR7...

【专利技术属性】
技术研发人员：路东晔，张国盛，黄海广，郝蕾，王爱君，
申请(专利权)人：内蒙古农业大学，
类型：发明
国别省市：内蒙古;15