一个玉米籽粒直链淀粉含量相关的分子标记制造技术

本发明专利技术公开了一个玉米籽粒直链淀粉含量相关的分子标记。本发明专利技术前期从以玉米自交系B73为背景的EMS突变体库中筛选到一个玉米籽粒直链淀粉含量增加的突变体，然后利用EcMutMap方法进行基因定位显示，该突变体的Ae1基因第12个外显子上有一个G→A的突变，导致色氨酸变为终止密码子，该突变体命名为ae1‑1。针对该变异，我们开发了对应的dCAPS分子标记及引物(SEQ ID NO.1‑4所示)，可以很好的用来区分Ae1基因的野生型和突变型(突变体显示144bp的片段；野生型被BamH I酶切割产生51+93bp片段)。该分子标记可以用来进行玉米籽粒高直链淀粉新品种的辅助选择。

【技术实现步骤摘要】
一个玉米籽粒直链淀粉含量相关的分子标记
本专利技术涉及一个玉米籽粒直链淀粉含量相关的分子标记，涉及分子遗传学领域。
技术介绍
玉米长期以来都是人类生存的基本食物来源，主要的动物饲料及重要的工业原料。我国玉米产量已居世界第二位，玉米籽粒中的淀粉由直链淀粉和支链淀粉组成，直链淀粉又称为抗性淀粉，具有重要的医疗保健价值。高直链淀粉是胆结石及高血压病人的理想食品，具有防止胆结石形成及降低血液胆固醇的作用。普通玉米的直链淀粉含量仅占总淀粉含量的25％(Smithetal.，2001；Myersetal.，2000)，而高直链淀粉玉米的直链淀粉含量均超过50％。培育高直链淀粉玉米杂交种是玉米品质改良研究的方向之一，由于我国高直链淀粉玉米种质资源比较匮乏(顾晓红，1998)，因此从突变体中筛选高直链淀粉种质资源具有重要的应用价值。我们前期从实验室构建的玉米EMS突变体库(MEMD，http://elabcaas.cn/memd/)中筛选得到一个直链淀粉含量增加的突变体(直链淀粉含量为39.12％，对应的野生型直链淀粉含量为17.01％)。基因克隆结果显示，该突变体中编码amylose-extender1蛋白(Ae1)的基因在第12个外显子上发生了G→A单碱基突变(导致第410位氨基酸由色氨酸Trp变为终止密码子)，该突变体命名为ae1-1。ae1-1直链淀粉含量是野生型2倍多，具有较大的应用前景，因此通过将其导入生产上常用的优良自交系中可获得具更高直链淀粉含量的新种质，为培育籽粒高直链淀粉玉米新品种提供了可能。r>尽管关于Ae1基因的突变体在增加玉米籽粒中直链淀粉含量方面有一定研究(程备久等，专利申请号：CN200910144387.7)，但不同遗传背景对ae1表型影响很大，以B73为遗传背景的ae1突变体研究及对应分子标记的开发鲜有报道。
技术实现思路
申请人前期从本实验室构建的以玉米自交系B73为背景的EMS突变体库中筛选到一个玉米籽粒直链淀粉含量增加的突变体(图1)，然后利用实验室开发的EcMutMap方法进行基因定位显示，该突变体的Ae1基因第12个外显子上有一个G→A的突变，导致色氨酸(Trp，W)变为终止密码子，该突变体命名为ae1-1。针对该变异，我们开发了对应的dCAPS分子标记及引物(采用Ae1基因的互补链设计dCAPS分子标记及引物，图2中表现为C→T的突变)，可以很好的用来区分Ae1基因的野生型和突变型。该分子标记可以用来进行玉米籽粒高直链淀粉新品种的辅助选择。本专利技术提供的一个玉米籽粒直链淀粉含量相关的分子标记，其特征是：与玉米籽粒直链淀粉野生型基因Ae1检测相关的核苷酸序列如下(SEQIDNO.1,加粗下划线碱基为单核苷酸位点变异SNP)：AAACCTGCATACGGATAAAATTGTTGGAACGATACAGGCAGAAAAATAGGAGAATAAAATTAATGGAGATAGAGCATTTTTGTTCCGTACTTCCCAGTTCCCATAGTTAAATAGGCGAGAATCCCACATCCAGTGATGGCCACGTGGACCACTGTGAAAGTAATGTGTATCTGTACCATCAAAACCATTCAACCCATCCAGAGTATTACTTGACGCATGACTGCAAGTAACACAAAAGCAAAGTTAAAGGTATGAAACCAAAGAGCTTCAAATAATCATAAGGTTGTACATAACAGATTATAATCGATCTCATCCCAAAGCTTGGAAGCCAAAGAACCTTGAACCACGACAAATAGGTTTCCA。与玉米籽粒直链淀粉突变体基因ae1检测相关的核苷酸序列如下(SEQIDNO.2，加粗下划线碱基为单核苷酸位点变异SNP)：AAACCTGCATACGGATAAAATTGTTGGAACGATACAGGCAGAAAAATAGGAGAATAAAATTAATGGAGATAGAGCATTTTTGTTCCGTACTTCCCAGTTCCCATAGTTAAATAGGCGAGAATCCCACATTCAGTGATGGCCACGTGGACCACTGTGAAAGTAATGTGTATCTGTACCATCAAAACCATTCAACCCATCCAGAGTATTACTTGACGCATGACTGCAAGTAACACAAAAGCAAAGTTAAAGGTATGAAACCAAAGAGCTTCAAATAATCATAAGGTTGTACATAACAGATTATAATCGATCTCATCCCAAAGCTTGGAAGCCAAAGAACCTTGAACCACGACAAATAGGTTTCCA。本专利技术所述扩增dCAPS分子标记的PCR引物，根据SEQIDNO.1和SEQIDNO.2的序列设计而来，由SEQIDNO.3(小写碱基是人为引入的接头序列，加粗下划线碱基为引入的错配)和SEQIDNO.4所示的核苷酸序列组成，其特征是：dCAPS-F：5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctAGTTAAATAGGCGAGAATCCCGGAT-3’(SEQIDNO.3)；dCAPS-R:5’-CATGCGTCAAGTAATACTCTGGATGGG-3’(SEQIDNO.4)。本专利技术还公开了一种应用上述分子标记引物鉴定玉米籽粒直链淀粉野生型基因Ae1和突变体基因ae1(直链淀粉含量高)的方法，其特征是：(1)以待测玉米材料的基因组DNA为模板，以上述SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示的引物进行PCR扩增；(2)对步骤(1)得到的PCR产物进行限制性内切酶(BamHI)酶切，后利用高浓度琼脂糖凝胶(3％)电泳进行分离，如果所得酶切产物仅有144bp的DNA片段，则待测玉米材料为具有ae1/ae1基因型且直链淀粉含量高的材料；若所得酶切产物为大小93bp和51bp的两个DNA片段，则待测玉米材料为具有Ae1/Ae1基因型且直链淀粉含量低的材料；若所得酶切产物为144bp、93bp和51p三个DNA片段，则待测玉米材料为具有Ae1/ae1杂合基因型且直链淀粉含量低的材料。进一步的，PCR体系(25μL)：正反向引物各1μL(10μmol/L)，基因组DNA1μL，EasyTaqDNA聚合酶0.2μL，buffer2.5μL，dNTPs2μL，ddH2O补足至25μL。PCR反应程序为：95℃预变形5min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃过度延伸5min；16℃保存。本专利技术的有益效果是：(1)本专利技术中筛选得到的ae1-1突变体表现为籽粒直链淀粉含量增加，在培育玉米高直链淀粉新品种方面具有潜在应用价值。(2)本专利技术提供了一个快速鉴定ae1-1突变体中Ae1基因单碱基突变的dCAPS分子标记，为分子标记辅助选择育种提供新的靶标，可以大大缩短育种周期。且dCAPS标记与直链淀粉含量表型在0.001水平上显著相关，用于高直链淀粉育种中分子辅助选择具本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一个玉米籽粒直链淀粉含量相关的分子标记，其特征是：/n与玉米籽粒直链淀粉野生型基因Ae1检测相关的核苷酸序列如下：/nAAACCTGCATACGGATAAAATTGTTGGAACGATACAGGCAGAAAAATAGGAGAATAAAATTAATGGAGATAGAGCATTTTTGTTCCGTACTTCCCAGTTCCCATAGTTAAATAGGCGAGAATCCCACATCCAGTGATGGCCACGTGGACCACTGTGAAAGTAATGTGTATCTGTACCATCAAAACCATTCAACCCATCCAGAGTATTACTTGACGCATGACTGCAAGTAACACAAAAGCAAAGTTAAAGGTATGAAACCAAAGAGCTTCAAATAATCATAAGGTTGTACATAACAGATTATAATCGATCTCATCCCAAAGCTTGGAAGCCAAAGAACCTTGAACCACGACAAATAGGTTTCCA；/n与玉米籽粒直链淀粉突变体基因ae1检测相关的核苷酸序列如下：/nAAACCTGCATACGGATAAAATTGTTGGAACGATACAGGCAGAAAAATAGGAGAATAAAATTAATGGAGATAGAGCATTTTTGTTCCGTACTTCCCAGTTCCCATAGTTAAATAGGCGAGAATCCCACATTCAGTGATGGCCACGTGGACCACTGTGAAAGTAATGTGTATCTGTACCATCAAAACCATTCAACCCATCCAGAGTATTACTTGACGCATGACTGCAAGTAACACAAAAGCAAAGTTAAAGGTATGAAACCAAAGAGCTTCAAATAATCATAAGGTTGTACATAACAGATTATAATCGATCTCATCCCAAAGCTTGGAAGCCAAAGAACCTTGAACCACGACAAATAGGTTTCCA。/n...

【技术特征摘要】
1.一个玉米籽粒直链淀粉含量相关的分子标记，其特征是：
与玉米籽粒直链淀粉野生型基因Ae1检测相关的核苷酸序列如下：
AAACCTGCATACGGATAAAATTGTTGGAACGATACAGGCAGAAAAATAGGAGAATAAAATTAATGGAGATAGAGCATTTTTGTTCCGTACTTCCCAGTTCCCATAGTTAAATAGGCGAGAATCCCACATCCAGTGATGGCCACGTGGACCACTGTGAAAGTAATGTGTATCTGTACCATCAAAACCATTCAACCCATCCAGAGTATTACTTGACGCATGACTGCAAGTAACACAAAAGCAAAGTTAAAGGTATGAAACCAAAGAGCTTCAAATAATCATAAGGTTGTACATAACAGATTATAATCGATCTCATCCCAAAGCTTGGAAGCCAAAGAACCTTGAACCACGACAAATAGGTTTCCA；
与玉米籽粒直链淀粉突变体基因ae1检测相关的核苷酸序列如下：
AAACCTGCATACGGATAAAATTGTTGGAACGATACAGGCAGAAAAATAGGAGAATAAAATTAATGGAGATAGAGCATTTTTGTTCCGTACTTCCCAGTTCCCATAGTTAAATAGGCGAGAATCCCACATTCAGTGATGGCCACGTGGACCACTGTGAAAGTAATGTGTATCTGTACCATCAAAACCATTCAACCCATCCAGAGTATTACTTGACGCATGACTGCAAGTAACACAAAAGCAAAGTTAAAGGTATGAAACCAAAGAGCTTCAAATAATCATAAGGTTGTACATAACAGATTATAATCGATCTCATCCCAAAGCTTGGAAGCCAAAGAACCTTGAACCACGACAAATAGGTTTCCA。


2.一个玉米籽粒直链淀粉含量相关的分子标记引物，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：路小铎，刘基生，秦莉，柴振光，
申请(专利权)人：齐鲁师范学院，
类型：发明
国别省市：山东;37