活性污泥中宏病毒组DNA的提取方法技术

本发明专利技术涉及一种活性污泥中宏病毒组DNA的提取方法，包括如下步骤：(1)取沉积的污泥，重悬于质量百分比浓度为0.8～1.5％的柠檬酸钾缓冲液中，经80～120W、15～25kHz超声混合2～5min，制得菌液；(2)将步骤(1)制得的菌液经去除微生物杂质，制得提取液；(3)将步骤(2)制得的提取液浓缩后，经DNaseI处理，制得去除杂质DNA的提取液；(4)将步骤(3)制得的去除杂质DNA的提取液经去除病毒蛋白壳体，然后经提取DNA，纯化，制得宏病毒组DNA。本发明专利技术所述方法不仅可有效提取出活性污泥宏病毒组DNA，还大大提高了宏病毒组DNA的得率和质量，并且操作简单、可行性强、成本低，具有广阔的应用前景。

Extraction of metavirus DNA from activated sludge

【技术实现步骤摘要】
活性污泥中宏病毒组DNA的提取方法
本专利技术涉及一种活性污泥中宏病毒组DNA的提取方法，属于生物技术

技术介绍
生物活性污泥法是当前生活废水、工业废水等处理的主要方式，它是一种利用悬浮生长的微生物絮体处理废水的好氧处理方法。活性污泥便是在此过程中微生物群体以及它们所依附的有机物和无机物的总称。活性污泥中的生物群落结构复杂，其中的细菌、真菌、病毒、原生动物和后生动物与废水中的有机物形成了复杂的食物链。一些细菌和真菌可直接代谢废水中的有机物，在废水净化过程中起到关键作用。原生动物和后生动物作为细菌的捕食者起到维持群落结构稳定性的作用。病毒作为一类特殊的群体，可以感染细菌、真菌、原生动物以及后生动物，也对活性污泥群落结构的稳定性起到重要作用。宏病毒组是在宏基因组理论的基础上，结合病毒的概念和技术兴起的新的学科分支。宏病毒组以环境中所有病毒的遗传物质为研究对象，用于鉴定环境中的病毒组成、发现新病毒、病毒溯源等。获得高质量的宏病毒组DNA，是对准确鉴定、分析环境中病毒群落组成等研究的必要条件。中国专利文献CN103789300A(申请号201410067311.X)公开了一种环氧丙烷皂化废水活性污泥宏基因组DNA的提取方法，主要通过氯化钠溶液初洗污泥，加入提取缓冲液、溶菌酶、十二烷基硫酸钠预处理，酚、氯仿异戊醇抽提，以及无水乙醇/乙酸钠沉淀宏基因组DNA等步骤，提取出环氧丙烷皂化废水活性污泥宏基因组DNA样品。中国专利文献CN102703430A(申请号201210180253.2)公开了一种高质量提取普洱茶渥堆发酵过程中微生物总DNA的方法，本方法包括使用超声波及涡旋震荡使普洱茶表面分离微生物；使用洗涤缓冲液对微生物进行洗涤；使用DNA提取液对微生物总DNA的粗提，对粗提DNA进行纯化的步骤。上述方法应用于活性污泥中宏病毒组DNA的提取时，会出现细菌等宿主DNA的污染。另外，现有文献上发表的宏病毒组DNA提取方法都存在DNA条带弥散、DNA质量不高、细菌DNA污染等问题，无法获得高质量宏病毒组DNA。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术不足，提供了一种活性污泥宏病毒组DNA的提取方法。本专利技术的技术方案如下：一种活性污泥宏病毒组DNA的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)取沉积的污泥，重悬于质量百分比浓度为0.8～1.5％的柠檬酸钾缓冲液中，经80～120W、15～25kHz超声混合2～5min，制得菌液；(2)将步骤(1)制得的菌液经去除微生物杂质，制得提取液；(3)将步骤(2)制得的提取液浓缩后，经DNaseI处理，制得去除杂质DNA的提取液；(4)将步骤(3)制得的去除杂质DNA的提取液经去除病毒蛋白壳体，然后经提取DNA，纯化，制得宏病毒组DNA。根据本专利技术优选的，所述步骤(1)中，沉积的污泥含水率不超过80％；进一步优选的，沉积的污泥为将污泥经4000～5000g离心6～8min，取沉淀制得。根据本专利技术优选的，所述步骤(1)中，沉积的污泥与柠檬酸钾缓冲液混合的质量体积比为1：(3～5)，单位g/ml。根据本专利技术优选的，所述步骤(1)中，超声混合的温度为0℃；优选的，超声混合过程中，每隔50～70秒，翻转震荡25～35秒；优选的，超声混合条件为：100W、20kHz超声混合3min。根据本专利技术优选的，所述步骤(1)中，柠檬酸钾缓冲液的质量百分比浓度为1％。根据本专利技术优选的，所述步骤(2)中，去除微生物杂质包括离心步骤和过滤步骤，离心步骤具体为：在4℃条件下，8000g离心20min，取上清液；过滤步骤具体为：采用孔径为0.22μm滤网过滤。根据本专利技术优选的，所述步骤(3)中，浓缩为采用30kd的超滤膜浓缩。根据本专利技术优选的，所述步骤(3)中，DNaseI的添加量为0.05～0.20U/μl；进一步优选的，DNaseI的添加量为0.1U/μl。根据本专利技术优选的，所述步骤(3)中，DNaseI处理条件为：37℃孵育20min。根据本专利技术优选的，所述步骤(4)中，去除病毒蛋白壳体的步骤如下：向去除杂质DNA的提取液中加入EDTA溶液至EDTA浓度为18～22mmol/L，然后加入SDS溶液至SDS的质量百分比浓度为0.3～0.8％，再加入蛋白酶K至浓度为40～60mg/L，在温度为52～60℃的条件下温浴45～75min，即得。根据本专利技术优选的，所述步骤(4)中，提取DNA的步骤如下：向去除病毒蛋白壳体的溶液中加入平衡酚，混合均匀，然后经离心，取有机相；向有机相中加入氯仿-异戊醇溶液，混合均匀，然后经离心，取上清，即得。进一步优选的，所述平衡酚与去除病毒蛋白壳体的溶液的体积比为1:1。进一步优选的，所述离心为在4℃、12000rpm条件下离心10min。进一步优选的，所述氯仿-异戊醇溶液中氯仿与异戊醇的体积比为24:1。根据本专利技术优选的，所述步骤(4)中，纯化包括醇沉、干燥和蒸馏水溶解步骤；进一步优选的，所述醇沉为向提取DNA步骤获得的提取液中加入10％体积的醋酸钠溶液和2倍体积冰预冷的无水乙醇，混合均匀，-20℃放置2～3h，离心，取沉淀，制得；更优的，所述醋酸钠溶液为浓度3M的醋酸钠溶液，pH5.4。更优的，所述的醇沉还包括对沉淀采用体积百分比为70％冰预冷的乙醇进行洗涤的步骤。进一步优选的，所述干燥为采用常温风干干燥。有益效果本专利技术首次发现现有宏基因组DNA提取方法无法有效提取活性污泥中宏病毒组DNA的原因，并根据这一原因，通过对活性污泥样品进行超声、过滤、超滤等前处理，将获得的宏病毒利用平衡酚、氯仿-异戊醇反复多次抽提，并将上述处理后样品进行醋酸钠/无水乙醇沉淀，最终获得高质量的宏病毒组DNA。本专利技术所述方法不仅可有效提取出活性污泥宏病毒组DNA，还大大提高了宏病毒组DNA的得率和质量，并且操作简单、可行性强、成本低，具有广阔的应用前景。附图说明图1为活性污泥宏病毒组DNA琼脂糖凝胶电泳图；其中：泳道M1和M3为DNAladder；泳道M2为实施例1提取的宏病毒组DNA。图2为活性污泥宏病毒组DNA琼脂糖凝胶电泳图；其中：泳道M1为DNAladder；泳道M2为对比例1提取的宏病毒组DNA；泳道M3为对比例2提取的宏病毒组DNA。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术的技术方案做进一步阐述，但本专利技术所保护范围不限于此。实施例1一种活性污泥宏病毒组DNA的提取方法，包括如下步骤：1.取污泥4000g离心6min，去上清。称取10g沉积的污泥，含水率75％，重悬在35ml的1％柠檬酸钾缓冲液中置于50ml无菌离心管中。用100W,20kHz在冰上超声污泥3min。每超声1min都要翻转震荡30秒。2.4℃，8,000g离心20min，使得菌体沉淀。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种活性污泥宏病毒组DNA的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：/n(1)取沉积的污泥，重悬于质量百分比浓度为0.8～1.5％的柠檬酸钾缓冲液中，经80～120W、15～25kHz超声混合2～5min，制得菌液；/n(2)将步骤(1)制得的菌液经去除微生物杂质，制得提取液；/n(3)将步骤(2)制得的提取液浓缩后，经DNaseI处理，制得去除杂质DNA的提取液；/n(4)将步骤(3)制得的去除杂质DNA的提取液经去除病毒蛋白壳体，然后经提取DNA，纯化，制得宏病毒组DNA。/n

【技术特征摘要】
1.一种活性污泥宏病毒组DNA的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取沉积的污泥，重悬于质量百分比浓度为0.8～1.5％的柠檬酸钾缓冲液中，经80～120W、15～25kHz超声混合2～5min，制得菌液；
(2)将步骤(1)制得的菌液经去除微生物杂质，制得提取液；
(3)将步骤(2)制得的提取液浓缩后，经DNaseI处理，制得去除杂质DNA的提取液；
(4)将步骤(3)制得的去除杂质DNA的提取液经去除病毒蛋白壳体，然后经提取DNA，纯化，制得宏病毒组DNA。


2.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(1)中，沉积的污泥含水率不超过80％；进一步优选的，沉积的污泥为将污泥经4000～5000g离心6～8min，取沉淀制得；
优选的，所述步骤(1)中，沉积的污泥与柠檬酸钾缓冲液混合的质量体积比为1：(3～5)，单位g/ml。


3.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(1)中，超声混合的温度为0℃；优选的，超声混合过程中，每隔50～70秒，翻转震荡25～35秒；优选的，超声混合条件为：100W、20kHz超声混合3min；
优选的，所述步骤(1)中，柠檬酸钾缓冲液的质量百分比浓度为1％。


4.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(2)中，去除微生物杂质包括离心步骤和过滤步骤，离心步骤具体为：在4℃条件下，8000g离心20min，取上清液；过滤步骤具体为：采用孔径为0.22μm滤网过滤。


5.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(3)中，浓缩为采用30kd的超滤膜浓缩；
优选的，所述步骤(3)中，DNaseI的添加量为0.05～0.20U/μl；进一步...

【专利技术属性】
技术研发人员：樊祥宇，崔润博，吴丹辰，朱宸汐，赵云迎，刘玉如，林丛，郑凯旋，李梓群，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：山东;37