分泌抗Wnt-7a单克隆抗体杂交瘤细胞株及其单抗、应用制造技术

本发明专利技术提供了分泌抗Wnt‑7a单克隆抗体杂交瘤细胞株，杂交瘤细胞株为1B8A2和/或4G6F3。本发明专利技术还提供了上述的分泌抗Wnt‑7a单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，单克隆抗体的抗原表位处于Wnt‑7a蛋白的C端或Wnt‑7a蛋白的M段，处于Wnt‑7a蛋白的C端的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；处于Wnt‑7a蛋白的M段的氨基酸序列如SEQID NO.4所示。本发明专利技术特异性强且灵敏度高，可通过配对检测体液、组织中Wnt‑7a蛋白含量，应用于检测Wnt‑7a蛋白过量表达或诊断以Wnt‑7a蛋白异常表达为表征的疾病的产品的应用。

Hybridoma cell line secreting monoclonal antibody against Wnt-7a and its monoclonal antibody and Application

【技术实现步骤摘要】
分泌抗Wnt-7a单克隆抗体杂交瘤细胞株及其单抗、应用
本专利技术属于生物
，特别涉及Wnt-7a单克隆抗体杂交瘤细胞株。
技术介绍
Wnt蛋白家族由19个分泌糖蛋白组成，主要通过与Frizzled(Fzd)受体结合参与细胞的增殖、分化及肿瘤生长等多种生物学过程。其中，Wnt-7a（即Wnt7a）属于Wnt家族中的经典Wnt信号分子,通过经典的Wnt/β-catenin信号过程参与多种恶性肿瘤的发生发展。Wnt-7a的分子量为39kDa，含有349个氨基酸，在分泌之前剪切为含有318个氨基酸、分子量为48KD的成熟蛋白。在氨基酸水平上，人Wnt-7a蛋白和小鼠的Wnt-7a蛋白具有98%的相似性。Wnt-7a通常在肺、睾丸、淋巴结和脑中表达，通过Wnt/β-catenin信号通路参与调控细胞的生命活动。Wnt信号通路对多种正常组织和癌组织的细胞增殖和分化起着重要的调控作用。Wnt信号分子是癌症诊断、治疗和预防以及再生医学、组织工程的有效靶点。己公布的数据显示Wnt-7a在不同类型的恶性肿瘤中表现出不同的表达模式。在浆液性卵巢癌中，CTNNB1未突变情况下，Wnt-7a通过CTNNB1(13-catenin)／TCF信号通路促进卵巢癌进展；在膀胱癌中，Wnt-7a的过表达促进了肿瘤的转移，并且高表达Wnt-7a蛋白的膀胱癌患者的总生存期较短；在乳腺癌中，Wnt-7a作为一种关键的肿瘤细胞分泌因子，通过诱导成纤维细胞活化而促进肿瘤细胞在体内转移，导致患者预后差。相反，在宫颈癌中，Wnt-7a可以抑制癌细胞的增殖和迁移。在小鼠中，Wnt-7a通过失活S期激酶相关蛋白(一种重要的细胞衰老的替代调节因子)诱导细胞衰老，从而抑制肺癌的发生；在白血病中，Wnt-7a也被鉴定为肿瘤抑制基因。因此Wnt-7a对于卵巢癌的预示具有重要的意义，而市场上现有的检测试剂盒，体系中多采用多克隆抗体，抗体特异性差，不能区分Wnt-7a高度同源家族蛋白，由于其抗体本身效价或特异性的原因，也使得其对Wnt-7a检测的临床效用受到局限，降低了样本检测的特异性，同时也对灵敏度产生一定的影响。因此急需获得特异性识别Wnt-7a蛋白单克隆抗体，满足临床样本检测要求，提高检测的灵敏度和特异性。现有的检测试剂盒体系中多采用多克隆抗体；抗体特异性差，不能区分Wnt-7a高度同源家族蛋白，由于其抗体本身效价或特异性的原因，也使得其对Wnt-7a检测的临床效用受到局限，降低了样本检测的特异性，同时也对灵敏度产生一定的影响。本专利技术通过双抗体夹心的原理，利用高亲和力高特异性配对单克隆抗体制备检测试剂盒，采用全自动化学发光仪检测样品浓度。
技术实现思路
为了解决上述存在的问题，本专利技术的目的之一在于提供一种分泌抗Wnt-7a单克隆抗体杂交瘤细胞株；本专利技术的目的之二在于提供分泌抗Wnt-7a单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体；本专利技术的目的之三在于提供含有所述单克隆抗体的试剂盒；本专利技术的目的之四在于提供所述单克隆抗体在制备检测Wnt-7a蛋白试剂中的应用。本专利技术技术方案的其中一方面，提供了分泌抗Wnt-7a单克隆抗体杂交瘤细胞株，杂交瘤细胞株为1B8A2和/或4G6F3，保藏于中国典型培养物保藏中心，（保藏中心地址为：中国.武汉.武汉大学，电话：027-68752319），1B8A2保藏编号为CCTCCNO:C202095,4G6F3保藏编号为CCTCCNO:C202096。本专利技术技术方案的其中一方面，提供了上述的分泌抗Wnt-7a单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，单克隆抗体的抗原表位处于Wnt-7a蛋白的C端或Wnt-7a蛋白的M段，处于Wnt-7a蛋白的C端的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示；处于Wnt-7a蛋白的M段的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。本专利技术技术方案的其中一方面，提供了Wnt-7a蛋白检测试剂盒，Wnt-7a蛋白检测试剂盒包含上述单克隆抗体包被的固相载体。在一些实施方式中固相载体可以是磁微粒。本专利技术技术方案的其中一方面，提供了Wnt-7a蛋白检测试剂盒，Wnt-7a蛋白检测试剂盒还包含校准品Wnt-7a蛋白、碱性磷酸酶标记的检测抗体和化学发光底物。本专利技术技术方案的其中一方面，提供了Wnt-7a蛋白检测试剂盒，化学发光底物为AMPPD，上述单克隆抗体包被的固相载体中的抗体为杂交瘤细胞株1B8A2分泌的单克隆抗体，检测抗体为杂交瘤细胞株4G6F3分泌的单克隆抗体。本专利技术技术方案的其中一方面，提供了上述单克隆抗体的应用，单克隆抗体用于制备检测Wnt-7a蛋白过量表达或诊断以Wnt-7a蛋白异常表达的试剂中。本专利技术技术方案的其中一方面，提供了上述单克隆抗体的应用，上述试剂用于制备Wnt-7a蛋白检测试剂盒。本专利技术技术方案的其中一方面，提供了分泌抗Wnt-7a单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备方法，使用引物为：Wnt-7a-F：5’-TACACGTGCAAGTGA-3’(SEQIDNO.1)；Wnt-7a-R：5’-CGCTTTCCGGTTCAT-3’)(SEQIDNO.2)。本专利技术提供的两种单克隆抗体可用于样品中Wnt-7a蛋白的检测，且特异性强、灵敏度高；两种单克隆抗体特异识别Wnt-7a的不同区段，特异性更好。可通过配对检测体液、组织中人Wnt-7a含量，应用于检测Wnt-7a蛋白过量表达或诊断以Wnt-7a蛋白异常表达为表征的疾病的产品的应用。本专利技术的有益效果在于：本专利技术通过获得分泌抗Wnt-7a单克隆抗体杂交瘤细胞株，获得针对Wnt-7a不同抗原表位的单克隆抗体2种，特异性强且灵敏度高，可通过配对检测体液、组织中Wnt-7a蛋白含量，应用于检测Wnt-7a蛋白过量表达或诊断以Wnt-7a蛋白异常表达为表征的疾病的产品的应用。附图说明图1为重组Wnt-7a蛋白SDS-PAGE电泳图；图2为1B8A2、3G5G2和4G6F3抗体SDS-PAGE电泳图；图3为Wnt-7a截断蛋白免疫印迹WB检测结果；图4为试剂条示意图；图5为ROC曲线图。具体实施方式下述的实施例是为了进一步说明本专利技术的一些优选实施例，并非全部实施例。本领域专业人员在没有进行创造性劳动的前提下做出的基于本专利技术的其他实施例，都属于本专利技术的权利保护范围。下面将结合附图对本专利技术作进一步的说明。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1、Wnt-7a的重组蛋白表达和纯化从卵巢癌组织提取RNA后经随机引物RT-PCR得到的cDNA为模板，设计引物进行Wnt-7a基因的克隆，引物具体为：Wnt-7a-F：5’-TACACGTGCAAGTGA-3’(SEQIDNO.1)；Wnt-7a-R：5’-CGCTTTCCGGTTCAT-3’)(SEQIDNO.2)。扩增的Wnt-7a基因插入到含有6×His标签本文档来自技高网...

【技术保护点】
1. 分泌抗Wnt-7a单克隆抗体杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株为1B8A2和/或4G6F3，保藏于中国典型培养物保藏中心，所述1B8A2保藏编号为CCTCC NO:C202095,所述4G6F3保藏编号为CCTCC NO:C202096。/n

【技术特征摘要】
1.分泌抗Wnt-7a单克隆抗体杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株为1B8A2和/或4G6F3，保藏于中国典型培养物保藏中心，所述1B8A2保藏编号为CCTCCNO:C202095,所述4G6F3保藏编号为CCTCCNO:C202096。


2.权利要求1所述的分泌抗Wnt-7a单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的抗原表位处于Wnt-7a蛋白的C端和/或Wnt-7a蛋白的M段，处于Wnt-7a蛋白的C端的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示；处于Wnt-7a蛋白的M段的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。


3.Wnt-7a蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述Wnt-7a检测试剂盒包含权利要求2所述的单克隆抗体包被的固相载体。


4.根据权利要求3所述的Wnt-7a蛋白检测...

【专利技术属性】
技术研发人员：庄光磊，臧荣余，狄文，
申请(专利权)人：苏州仁端生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32