一种高效人工根际联合固氮体系制造技术

本发明专利技术提供了一种根据合成生物学理论与方法构建的高效人工根际联合固氮体系。分别人工设计了两种全新的功能模块：即在固氮微生物底盘中构建的“Neb+amtR”泌铵基因模块和用在水稻、玉米和小麦等非豆科作物底盘中构建的“Ham”氮高效利用模块，并在作物根际通过种子包衣等接种技术，实现上述两种人工模块的功能偶联。与现有技术的联合固氮系统相比，本发明专利技术的人工根际联合固氮体系具有更高的生物固氮效率和植物促生效果。

An efficient nitrogen fixation system for artificial Rhizosphere

【技术实现步骤摘要】
一种高效人工根际联合固氮体系
本专利技术属于合成生物学
，具体涉及一种高效人工根际联合固氮体系及其用途。
技术介绍
氮肥投入是农业生产者获得高产的必要途径。但是目前氮利用效率普遍不高，导致过度使用。植物根际是土壤-植物进行物质交换的活跃界面，也是宿主植物和微生物相互作用的主要活动区。联合固氮体系广泛存在于水稻、玉米等非豆科作物根际，但是天然的联合固氮体系有许多缺陷，如受根际生物逆境影响大、固氮效率低下以及野生固氮菌根表抗逆能力和耐铵能力弱、传统农作物根系氮利用能力弱。合成生物学是以系统化设计和工程化构建为理念的汇聚交叉学科，是新一代颠覆性生物技术的发展前沿。合成生物学利用工程化的设计理念，在作为“底盘”的活体宿主或用于转录和翻译的体外系统中，实现从元件到模块再到系统的“自下而上”设计。利用生物系统的DNA、RNA、蛋白质等生物大分子作为候选“元器件”进行人工设计和智能改造，利用转录调控、代谢调控等生物功能将这些人工元器件关联起来，创建人工“功能模块”、“调控回路”或“智能系统”，实现更高效、更节能或更环保的全新生物功能。传统的增强植物氮素利用效率的研究主要围绕两方面技术开展：一是通过对植物底盘的性能改良，人工设计氮高效利用功能模块，使植物对氮素的亲和力增强；二是人工设计固氮菌固氮及耐铵泌铵等模块，提高根际固氮微生物的固氮效率，使固氮微生物为植物提供更多生物固定的氮素。但是，传统的方法存在研究周期长、微生物和植物的改良技术和应用都相对独立等诸多缺陷。因此，利用合成生物学技术建立一种全新的人工根际联合固氮体系，对于提高氮肥利用率并降低农业生产中对氮肥的依赖具有十分重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是建立一种全新的人工根际联合固氮体系。本专利技术的人工根际联合固氮体系，是运用合成生物学技术，分别人工设计并构建两种全新的功能模块：固氮微生物底盘构建的固氮泌铵基因模块和非豆科植物底盘构建的氮高效利用模块，并在作物根际通过种子包衣等接种技术，将上述两种模块实现功能偶联。即，在具有氮高效利用功能模块的重组植物(氮高效利用植物底盘)中接种具有固氮泌铵基因模块的重组固氮工程菌(固氮微生物底盘)，以实现二者功能的协同。所述固氮泌铵基因模块，是包括人工设计的固氮激活蛋白Neb(由SEQIDNO.1所示的DNA序列编码)功能模块和amtR(SEQIDNO.2所示DNA序列的基因)铵转运功能模块。所述植物底盘的氮高效利用模块，是人工设计的铵高亲蛋白Ham功能模块。本专利技术设计并构建了三种植物底盘，具体为：含有基因Ham和基因bar的重组玉米；含有基因Ham和基因hyg的重组水稻；含有基因Ham和基因NPTII的重组小麦。其中，Ham是铵高亲蛋白Ham的编码基因，由本专利技术首次人工合成，其核苷酸序列为SEQIDNO.3所示。上述人工根际联合固氮体系的构建方法，包括：1)获得固氮泌铵模块，将所述固氮泌铵模块导入固氮微生物中，获得含所述固氮泌铵模块的重组微生物；2)获得氮高效利用模块，将所述氮高效利用模块导入植物中，获得含所述氮高效利用模块的重组植物。3)在作物根际通过种子包衣等接种技术，将固氮微生物底盘泌铵模块与植物底盘的氮高效利用模块实现功能偶联。本专利技术的高效人工根际联合固氮体系的应用方法，是在含氮高效利用模块的重组植物根际中接种含有固氮泌铵基因模块的重组固氮微生物。因此，本专利技术构建了以下人工根际联合固氮体系：neb+amtR泌铵工程菌与Ham+bar玉米品系neb+amtR泌铵工程菌与Ham+hyg水稻品系neb+amtR泌铵工程菌与Ham+NPTII小麦品系经测定植物生长量和生物固氮量，评价促生效果和固氮效率发现，本专利技术提供的上述人工根际联合固氮体系的固氮效果均非常显著。具体来讲，本专利技术进行了如下工作：1、构建微生物高效固氮泌铵基因模块用施氏假单胞菌A1501(PseudomonasstutzeriA1501)作为模式联合固氮菌，构建高效泌铵固氮微生物底盘。人工设计高效铵转运蛋白基因amtR，采用高铵条件下的启动子。在限氮条件下，铵高亲和力amtR蛋白将细胞外的铵转运到细胞内。通过以下人工设计的功能模块，构建提高固氮酶的耐铵和泌铵能力的工程菌：通过对野生型A1501进行人工设计固氮激活Neb功能模块，将Neb功能模块和amtR功能模块转入野生型菌株中，获得泌铵固氮工程菌。2、分别构建三种植物底盘的氮高效利用模块1)在玉米中构建氮高效玉米品系将玉米作为模式植物，用人工合成的目的基因构建氮高效利用玉米底盘。方法是：将目的基因构建到pCAMBIA3300-bar表达载体(购买自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心BiovectorScienceLab，Inc)上，以玉米HiII为受体，通过农杆菌介导的玉米幼胚转化法获得。除草剂筛选、PCR、RT-PCR、Southernblot等技术验证目的基因插入玉米基因组中，稳定表达，且多世代稳定遗传。以此获得氮高效玉米品系。氮高效玉米品系所用的目的基因是：通过人工合成的铵高亲蛋白的目的基因Ham和抗除草剂草铵膦筛选基因bar。2)在水稻中构建氮高效水稻品系将水稻作为模式植物，用人工合成的目的基因构建氮高效利用水稻底盘。方法是：将目的基因构建到pCXK1301-hyg表达载体(购买自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心BiovectorScienceLab，Inc)上，以水稻IR8为受体，通过农杆菌介导的水稻幼胚转化法获得。抗生素筛选、PCR、RT-PCR、Southernblot等技术验证目的基因插入水稻基因组中，稳定表达，且多世代稳定遗传。以此获得氮高效水稻品系。氮高效水稻品系所用的目的基因是：通过人工合成的铵高亲蛋白的目的基因Ham和抗潮霉素筛选基因hyg。3)在小麦中构建氮高效小麦品系将小麦作为模式植物，用人工合成的目的基因构建氮高效利用小麦底盘。方法是：将目的基因构建到pCAMBIA1301-35S-NPTII表达载体(购买自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心BiovectorScienceLab，Inc)上，以小麦京411为受体，通过农杆菌介导的小麦幼胚转化法获得。抗生素筛选、PCR、RT-PCR、Southernblot等技术验证目的基因插入小麦基因组中，稳定表达，且多世代稳定遗传。以此获得氮高效小麦品系。氮高效小麦品系所用的目的基因是：通过人工合成的铵高亲蛋白的目的基因Ham和抗卡那霉素筛选基因NPTII。3、微生物和植物底盘的功能适配与田间应用考察将上述泌铵工程菌分别和氮高效玉米、水稻和小麦进行组合，形成以下三个人工根际联合固氮体系(图1)，分别是neb+amtR泌铵工程菌与Ham+bar玉米品系neb+amtR泌铵工程菌与Ham+hyg水稻品系neb+amtR本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人工根际联合固氮体系，由固氮微生物底盘构建的固氮泌铵基因模块和非豆科植物底盘的氮高效利用模块组成；/n所述固氮泌铵基因模块，是含有人工设计的固氮激活蛋白Neb功能模块和amtR铵转运模块的重组工程菌；所述固氮激活蛋白Neb，由SEQ ID NO.1所示的DNA序列编码；所述amtR铵转运模块，是SEQ ID NO.2所示DNA序列的基因；/n所述植物底盘的氮高效利用模块，是含有人工合成的铵高亲蛋白Ham的重组植物；所述铵高亲蛋白Ham由SEQ ID NO.3所示的DNA序列编码。/n

【技术特征摘要】
1.一种人工根际联合固氮体系，由固氮微生物底盘构建的固氮泌铵基因模块和非豆科植物底盘的氮高效利用模块组成；
所述固氮泌铵基因模块，是含有人工设计的固氮激活蛋白Neb功能模块和amtR铵转运模块的重组工程菌；所述固氮激活蛋白Neb，由SEQIDNO.1所示的DNA序列编码；所述amtR铵转运模块，是SEQIDNO.2所示DNA序列的基因；
所述植物底盘的氮高效利用模块，是含有人工合成的铵高亲蛋白Ham的重组植物；所述铵高亲蛋白Ham由SEQIDNO.3所示的DNA序列编码。


2.权利要求1所述的人工根际联合固氮体系，所述重组植物选自以下之一：
含有基因Ham和基因bar的重组玉米；
含有基因Ham和基因hyg的重组水稻；
含有基因Ham和基因NPTII的重组小麦。


3.权利要求1所述的人工根际联合固氮体系的构建方法，包括：
1)将所述固氮泌铵模块导入固氮微生物中，...

【专利技术属性】
技术研发人员：柯秀彬，林敏，燕永亮，战嵛华，陆伟，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11