一种lysC基因改造的重组菌株及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种核苷酸序列以及包括该多核苷酸序列的重组菌株，是对谷氨酸棒杆菌中的lysC基因的启动子区域序列进行点突变形成，突变后的启动子区域基因序列如SEQ ID NO:2所示。该重组菌株与未突变的菌株相比，提高了L‑赖氨酸产量，且菌株稳定性好，作为L‑赖氨酸生产菌株能够进一步降低生产成本。

【技术实现步骤摘要】
一种lysC基因改造的重组菌株及其构建方法与应用
本专利技术属于基因工程和微生物
，具体涉及一种lysC基因改造的重组菌株及其构建方法与应用。
技术介绍
L-赖氨酸是人体和动物所不能合成的八种必需氨基酸中最重要的一种。目前，赖氨酸是目前全球使用量最大的氨基酸类饲料添加剂，约90％的L-赖氨酸产品用于饲料添加剂，约5％用作食品添加剂，其余5％用作医药中间体。如豆粕中添加适量的L-赖氨酸可以大大提高蛋白质的利用率，促进禽畜生长。由于国内饲料工业惊人的发展速度，L-赖氨酸的市场需求与日俱增。但由于发酵产酸水平较低，生产规模较小，致使生产成本较高，难与同进口产品竞争。因此，很有必要选育L-赖氨酸高产菌，是我国的赖氨酸工业具有国际竞争力。最早，生产L-赖氨酸的方法是蛋白质水解法，后来发展的化学合成法使用剧毒原料，存在严重的环保问题，酶法因酶活性不稳定、规模小成本高等被慢慢淘汰，直到1960年日本采用微生物直接发酵生产赖氨酸获得成功，才真正推动了赖氨酸生产的研究开发，直接发酵法是目前广泛采用的赖氨酸生产方法。然而，随着国家对节约型社会的倡导，在L-赖氨酸生产过程中如何做到节能减排，降低能耗和环境污染成为摆在每个L-赖氨酸生产企业的严峻课题。因此，选育具有自主知识产权的高L-赖氨酸合成、低副产物积累的生产菌株，对实现企业可持续发展具有重要意义。利用微生物发酵生产L-赖氨酸，其途径中存在多个关键性酶参与L-赖氨酸的合成。例如糖-1，6-二磷酸酶(FBPase)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)、6-磷酸葡萄糖脱氢酶(6PGDH)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GADPH)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCx)、丙酮酸羧化酶(PCx)、天冬氨酸激酶(AK)、天冬氨酸半醛脱氢酶(ASADH)等。其中AK由lysC基因编码，其是合成L-赖氨酸中的关键酶之一。棒杆菌是氨基酸生产中使用的最重要的菌种，其包括谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、黄色棒杆菌(C.flavum)、钝齿棒杆菌(C.crenatum)、北京棒杆菌等，其中部分菌株的天冬氨酸激酶的研究已有报道。
技术实现思路
本专利技术提供一种启动子核苷酸序列，其包括SEQIDNO:1所示的启动子区域第-45bp位和第-47bp位碱基发生突变形成的核苷酸序列。根据本专利技术，SEQIDNO:1所示的启动子区域的第-45bp位核苷酸鸟嘌呤(G)突变为腺嘌呤(A)、第-47bp位的核苷酸鸟嘌呤(G)突变为胸腺嘧啶(T)。根据本专利技术，所述启动子核苷酸序列如下所述：(a)SEQIDNO:2所示的核苷酸序列；或者是，(b)与SEQIDNO:2所示的核苷酸序列具有90％以上，优选的具有95％、98％以上同一性的核苷酸序列，且其保留(a)所述启动子的增强活性，并且第-45bp位保持为腺嘌呤(A)、第-47bp位保持为胸腺嘧啶(T)。本专利技术还提供一种包含上述启动子的表达盒，包含所述启动子和可操纵地连接在所述启动子后的编码序列。在本专利技术的一个实施方案中，所述编码序列为lysC基因的编码序列。本专利技术还提供一种包含本专利技术的启动子核苷酸序列的重组载体。根据本专利技术，将本专利技术的启动子核苷酸序列与穿梭质粒相连接来构建所述重组载体；作为本专利技术的一个实施方案，所述穿梭质粒为pK18mobsacB质粒。本专利技术还提供一种包含上述启动子核苷酸序列或上述重组载体的重组菌株。根据本专利技术的重组菌株，其包含SEQIDNO:2所示的核苷酸序列。所述SEQIDNO:2所示的核苷酸序列为lysC基因的启动子区域。进一步地，所述SEQIDNO:2所示的核苷酸序列连接lysC基因编码序列。具体地，所述重组菌株可以包括本专利技术上述的表达盒或者重组载体。具体地，本专利技术的重组菌株由表达盒或者重组载体转化得到。根据本专利技术的重组菌株，是将上述突变的启动子核苷酸序列导入宿主菌株中重组形成；所述宿主菌株可以选自本领域已知的产L-赖氨酸的菌株，例如选自棒杆菌中的至少一种，所述棒杆菌可以为谷氨酸棒杆菌、黄色棒杆菌、钝齿棒杆菌、北京棒杆菌；优选谷氨酸棒杆菌。作为本专利技术的一个实施方案，所述宿主菌株为YP97158(保藏编号：CGMCCNo.12856，保藏日期：2016年8月16日，保藏单位：中国科学院微生物研究所)。根据本专利技术的重组菌株，是以pK18mobsacB质粒为载体。根据本专利技术的重组菌株，还可进一步包括其他改造。本专利技术还提供一种产L-赖氨酸的重组菌株的构建方法，包括如下步骤：(1)改造如SEQIDNO:1所示的启动子区域，使其第-45bp位和第-47bp位发生突变，得到包含突变的启动子区域的核苷酸序列。根据本专利技术，所述突变是指SEQIDNO:1所示的启动子区域的第-45bp位核苷酸鸟嘌呤(G)突变为腺嘌呤(A)、第-47bp位的核苷酸鸟嘌呤(G)突变为胸腺嘧啶(T)。具体地，所述突变后的启动子区域地核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。进一步地，所述构建方法还包括如下步骤：(2)将所述突变的启动子区域核苷酸序列与质粒连接，构建重组载体；(3)将所述重组载体导入宿主菌株，得到所述包含突变的启动子区域的产L-赖氨酸重组菌株。根据本专利技术，所述步骤(1)中，使所述发生突变的方法包括诱变、PCR定点突变或同源重组，优选PCR定点突变法。根据本专利技术，所述步骤(1)包括：设计两对扩增lysC基因的启动子区域的引物，再通过PCR技术得到突变的启动子区域核苷酸序列。在本专利技术的一个实施方案中，所述步骤(1)中的引物为：P1:5'CCGGAATTCGACCAAGGATGAGGGCTTTG3'(EcoRI)(SEQIDNO:3)P2:5'AGTTACCCGCTCAATTATACCTTTATAAAC3'(SEQIDNO:4)P3:5'GTTTATAAAGGTATAATTGAGCGGGTAACT3'(SEQIDNO:5)P4:5'ACATGCATGCGCGTACGCGAAGTGGCACAT3'(SphI)(SEQIDNO:6)。在本专利技术的一个实施方案中，所述步骤(1)包括：以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为模板，分别以引物P1和P2，P3和P4，进行PCR扩增，获得两条含有DNA片段；以上述两条DNA片段为模板，以P1和P4为引物，通过重叠PCR扩增(OverlapPCR)，得到包含本专利技术的启动子区域核苷酸序列(SEQIDNO:2)的DNA片段。根据本专利技术，步骤(1)中，通过重叠PCR扩增(OverlapPCR)，获得的DNA片段两端分别含有EcoRI和SphI酶切位点。根据本专利技术，所述步骤(2)包括：对于重叠PCR反应扩增的产物进行琼脂糖凝胶电泳和分离纯化，将片段双酶切(EcoRI/SphI)后，与同样双酶切(EcoRI/SphI)后的穿梭质粒相连接，获得等位替换重组载体。根据本专利技术，所述穿梭质粒为pK18mobsacB质粒；所构建本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种启动子核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:1所示的启动子区域第-45bp位和第-47bp位碱基发生突变形成的核苷酸序列。/n优选地，SEQ ID NO:1所示的启动子区域的第-45bp位核苷酸鸟嘌呤(G)突变为腺嘌呤(A)、第-47bp位的核苷酸鸟嘌呤(G)突变为胸腺嘧啶(T)。/n

【技术特征摘要】
1.一种启动子核苷酸序列，其包括SEQIDNO:1所示的启动子区域第-45bp位和第-47bp位碱基发生突变形成的核苷酸序列。
优选地，SEQIDNO:1所示的启动子区域的第-45bp位核苷酸鸟嘌呤(G)突变为腺嘌呤(A)、第-47bp位的核苷酸鸟嘌呤(G)突变为胸腺嘧啶(T)。


2.根据权利要求1的启动子核苷酸序列，其包括：
(a)SEQIDNO:2所示的核苷酸序列；或者是，
(b)与SEQIDNO:2所示的核苷酸序列具有90％以上，优选的具有95％、98％以上同一性的核苷酸序列，且其保留(a)所述启动子的增强活性，并且第-45bp位保持为腺嘌呤(A)、第-47bp位保持为胸腺嘧啶(T)。


3.一种表达盒，包含权利要求1或2所述的启动子核苷酸序列和可操纵地连接在所述启动子核苷酸序列后的编码序列。优选地，所述编码序列为lysC基因的编码序列。


4.一种重组载体，包含权利要求1的启动子核苷酸序列。
优选地，所述启动子核苷酸序列与穿梭质粒相连接来构建所述重组载体；优选地，所述穿梭质粒为pK18mobsacB质粒。


5.一种重组菌株，包含权利要求1的启动子核苷酸序列或权利要求4的重组载体。优选地，其包含SEQIDNO:2所示的核苷酸序列。优选地，所述重组菌株包含SEQIDNO:2所示的核苷酸序列连接lysC基因编码序列。


6.根据权利要求5的重组菌株，是将所述启动子核苷酸序列导入宿主菌株中重组形成；优选地，所述宿主菌株是谷氨酸棒杆菌，例如YP97158。优选地，所述重组菌株是以pK18mobsacB质粒为载体。


7.一种产L-赖氨酸的重组菌株的构建方法，包括如下步骤：
(1)改造如SEQIDNO:1所示的启动子区域...

【专利技术属性】
技术研发人员：孟刚，魏爱英，马风勇，贾慧萍，周晓群，高晓航，
申请(专利权)人：内蒙古伊品生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：内蒙古;15