一种酶法模块和Sda糖抗原合成方法技术

本发明专利技术涉及一种酶法模块和Sda糖抗原合成方法，涉及六种酶法模块，其中一种包括长双歧杆菌N‑乙酰氨基葡萄糖激酶、大肠杆菌糖核苷生成酶以及空肠弯曲杆菌β1‑4‑N‑乙酰氨基葡萄糖转移酶。利用空肠弯曲杆菌β1‑4‑N‑乙酰氨基葡萄糖转移酶替代人源的β1‑4‑N‑乙酰氨基葡萄糖转移酶引入GalNAc，构建Sda糖抗原表位；并利用幽门螺杆菌α1‑2岩藻糖转移酶、幽门螺杆菌α1‑3‑N‑乙酰氨基葡萄糖转移酶和人源的α1‑3‑半乳糖转移酶快速、高效的合成Sda糖抗原和ABH抗原相关联的杂合型Sda糖抗原。

【技术实现步骤摘要】
一种酶法模块和Sda糖抗原合成方法
本专利技术属于糖抗原制备
，具体涉及一种酶法模块和Sda糖抗原合成方法。
技术介绍
公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。早在1967年，科学家们发现了一种新的组织血型抗原—Sda糖抗原。Sda糖抗原广泛分布于人体的红细胞、体液和组织器官中。Sda糖抗原的抗原决定簇是一个三糖结构，即Siaα2,3(GalNAcβ1,4)Gal(如图1所示)。Sda糖抗原在生理和病理方面起到重要的作用。作为一种血型抗原，Sda不仅在血液分型、抗糖抗体筛选中发挥作用，而且在生殖、神经肌肉疾病、癌症以及疟疾感染等过程中扮演着重要的角色。近年来，随着对动物异种器官移植研究的深入，Sda作为一种异种抗原再次进入到人们的视野。在对猪的异种器官移植研究过程中发现来自猪体内的Sda糖抗原可以引起人体的自然免疫从而产生排异反应，也由此证明了Sda糖抗原不只存在于人体，在一些动物体内也会有分布，但是它们的抗原决定簇与人体内的Sda糖抗原决定簇存在差异，究其原因是因为猪体内含有人体中不含有的唾液酸类型N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)。Sda血型抗原为非ABO血型抗原，但是两种的抗原决定簇可以同时存在于一个结构中，形成一种杂合型多糖抗原，在人体中发挥作用。Sda血型抗原多糖种类复杂多样，现已明确的Sda类型主要有：tpye1Sda，type2Sda，core1Sda，core2Sda，core3Sda，paragloboside以及ABH抗原相关联的杂合型Sda糖抗原。研究表明，在人体内，Sda糖抗原合成的关键酶是β1-4-N-乙酰氨基半乳糖基转移酶B4GalNTII。2018年，有研究者利用从人体卵巢中获得的B4GalNTII酶进行了Sda的体外合成，但是产量极低，很难达到制备级水平。由于生物体内环境十分复杂，就目前的研究水平而言，以提取的方式从生物体内获得大量结构单一的目标寡糖用于生物学、药学研究的可能性微乎其微。对于化学合成而言，Sda糖链在合成过程中需要反复的保护以及脱保护操作来保证区域、立体选择性，导致其反应步骤多、总体收率低。以酶法模块化组装策略合成复杂寡糖可以克服化学合成法的不足，但是以哺乳动物来源的酶合成Sda糖抗原面临两方面的困难：1、哺乳动物来源的酶多为跨膜蛋白，在体外重组表达困难，难以获得足量的活性可溶性蛋白；2、哺乳动物来源的酶往往具有较强的底物专一性，底物适用性窄。
技术实现思路
针对上述现有技术中存在的问题，本专利技术的目的是提供一种酶法模块和Sda糖抗原合成方法。利用空肠弯曲杆菌β1-4-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(CjCgtA)替代人源的β1-4-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶引入GalNAc，构建Sda糖抗原表位；并利用幽门螺杆菌α1-2岩藻糖转移酶(Hmα1,2FucT)、幽门螺杆菌α1-3-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(BgtA)和人源的α1-3-半乳糖转移酶(GTB)快速、高效的合成Sda糖抗原和ABH抗原相关联的杂合型Sda糖抗原。为了解决以上技术问题，本专利技术的技术方案为：第一方面，一种酶法模块，包括长双歧杆菌N-乙酰氨基葡萄糖激酶(NahK)、大肠杆菌糖核苷生成酶(GlmU)以及空肠弯曲杆菌β1-4-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(CjCgtA)。记为酶法模块C，用于合成Siaα2,3(β1,4GalNAc)Gal表位中的GalNAcβ1,4Gal糖苷键以及其它含有GalNAcβ1,4Gal糖苷键的结构。本专利技术提出了用于合成Sda糖抗原的酶法模块，在一个模块中，各种酶相互配合实现Sda糖抗原合成，催化效率高，催化专一性强，酶的来源广泛。在多酶反应的过程中精准的构建目标糖苷键。一种酶法模块，包括脑膜炎奈瑟菌糖核苷生成酶(NmCSS)、多杀巴斯德菌α2-3唾液酸转移酶。在本专利技术的一些实施方式中，多杀巴斯德菌α2-3唾液酸转移酶为PmST1M144D或PmST3。分别记为酶法模块A和酶法模块B。PmST1M144D和PmST3用于构建Sda糖抗原表位中的Siaα2,3Gal糖苷键。一种酶法模块，包括脆弱拟杆菌岩藻糖激酶(FKP)、脆弱拟杆菌糖核苷生成酶(FKP)、幽门螺杆菌α1-2岩藻糖转移酶(Hmα1,2FucT)。记为酶法模块D，用于引入Fucα1,2Gal糖苷键，以在Sda糖抗原中引入H抗原，合成H抗原杂合型Sda糖抗原。一种酶法模块，包括长双歧杆菌N-乙酰氨基葡萄糖激酶(NahK)、大肠杆菌糖核苷生成酶(GlmU)以及幽门螺杆菌α1-3-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(BgtA)。记为酶法模块E，用于引入GalNAcα1,3Gal糖苷键，构建A抗原表位[Fucα1,2(GalNAcα1,3)Gal]，合成A抗原杂合型Sda糖抗原。一种酶法模块，包括大肠杆菌半乳糖激酶(EcGalK)、双歧杆菌糖核苷生成酶(BLUSP)以及半乳糖转移酶(GTB)。记为酶法模块F，用于引入Galα1,3Gal糖苷键，构建B抗原表位[Fucα1,2(Galα1,3)Gal]，合成B抗原杂合型Sda糖抗原。第二方面，上述酶法模块在合成Sda糖抗原中的应用。第三方面，一种Sda糖抗原的合成方法，所述方法为利用Sda糖抗原核心结构和酶法模块完成Sda糖抗原决定簇的组装得到非杂合型Sda糖抗原；或，Sda糖抗原核心结构和酶法模块完成ABH抗原相关联的杂合型Sda糖抗原的结构合成。本专利技术提出了利用酶法模块化组装合成寡糖化合物的方法，在Sda糖抗原核心结构上、利用酶进行组装得到非杂合型和杂合型两种类型的Sda糖抗原。在本专利技术的一些实施方式中，Sda糖抗原核心结构为如式I、式II、式III、式IV、式V、式VI所示：R1为羟基、叠氮取代烷基、炔基取代烷基、巯基取代烷基、丝氨酸残基、苏氨酸残基、多肽、蛋白、脂质、糖类等。在本专利技术的一些实施方式中，式IV所示Sda糖抗原核心结构的合成方法为将三糖糖苷[Galβ1,4(GlcNAcα1,3)GalNAcOR1]作为酶反应受体与半乳糖、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)、尿嘧啶核苷三磷酸(UTP)、MgCl2、Tris-HCl缓冲液、大肠杆菌半乳糖激酶(EcGalK)、双歧杆菌糖核苷生成酶(BLUSP)以及脑膜炎奈瑟菌β1-4半乳糖转移酶(NmLgtB)混合进行反应得到式(IV)所示的α构型糖苷Galβ1,4(Galβ1,4GlcNAcα1,3)GalNAcOR1。优选的，三糖糖苷的合成方法为N-乙酰氨基半乳糖通过保护基策略得到了适当的单糖受体，与全乙酰化的半乳糖硫苷供体在N-碘代丁二酰亚胺(NIS)和三氟甲磺酸(TfOH)的催化下进行糖苷化反应，得到全保护的二糖中间体；将此二糖结构经脱保护裸露出羟基后作为糖苷化受体，与端基是三氯乙酰亚胺酯、其余羟基被乙酰基保护的N-乙酰氨基葡萄糖受体反应，得到全保护的三糖，经脱保护操作得到三糖糖苷[Gal本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种酶法模块，其特征在于：包括长双歧杆菌N-乙酰氨基葡萄糖激酶、大肠杆菌糖核苷生成酶以及空肠弯曲杆菌β1-4-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶。/n

【技术特征摘要】
1.一种酶法模块，其特征在于：包括长双歧杆菌N-乙酰氨基葡萄糖激酶、大肠杆菌糖核苷生成酶以及空肠弯曲杆菌β1-4-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶。


2.一种酶法模块，其特征在于：包括脑膜炎奈瑟菌糖核苷生成酶、多杀巴斯德菌α2-3唾液酸转移酶；
优选的，多杀巴斯德菌α2-3唾液酸转移酶为PmST1M144D或PmST3。


3.一种酶法模块，其特征在于：包括脆弱拟杆菌岩藻糖激酶、脆弱拟杆菌糖核苷生成酶、幽门螺杆菌α1-2岩藻糖转移酶。


4.一种酶法模块，其特征在于：包括长双歧杆菌N-乙酰氨基葡萄糖激酶、大肠杆菌糖核苷生成酶以及幽门螺杆菌α1-3-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶。


5.一种酶法模块，其特征在于：包括大肠杆菌半乳糖激酶、双歧杆菌糖核苷生成酶以及半乳糖转移酶。


6.权利要求1-5任一所述的酶法模块在合成Sda糖抗原中的应用。


7.一种Sda糖抗原的合成方法，其特征在于：利用Sda糖抗原核心结构和酶法模块完成Sda糖抗原决定簇的组装得到非杂合型Sda糖抗原；
或，Sda糖抗原结构和酶法模块完成ABH抗原相关联的杂合型Sda糖抗原的结构合成。


8.如权利要求7所述的Sda糖抗原的合成方法，其特征在于：Sda糖抗原核心结构为如式I、式II、式III、式IV、式V、式VI所示：



R1为羟基、叠氮取代烷基、炔基取代烷基、巯基取代烷基、丝氨酸残基、苏氨酸残基、多肽、蛋白、脂质、糖类等；
优选的，式IV所示Sda糖抗原核心结构的合成方法为将三糖糖苷[Galβ1,4(GlcNAcα1,3)GalNAcOR1]作为酶反应受体与半乳糖、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)、尿嘧啶核苷三磷酸(UTP)、MgCl2、Tris-HCl缓冲液、大肠杆菌半乳糖激酶(EcGalK)、双歧杆菌糖核苷生成酶(BLUSP)以及脑膜炎奈瑟菌β1-4半乳糖转移酶(NmLgtB)混合进行反应得到式(IV)所示的α构型糖苷Galβ1,4(Galβ1,4GlcNAcα1,3)GalNAcOR1；
优选的，式V所示Sda糖抗原核心结构的合成方法为将二糖糖苷GlcNAcα1,3GalNAcOR1作为酶反应的受体与半乳糖、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)、尿嘧啶核苷三磷酸(UTP)、MgCl2、Tris-HCl缓冲液、大肠杆菌半乳糖激酶(EcGalK)、双歧杆菌糖核苷生成酶(BLUSP)以及脑膜炎奈瑟菌β1-4半乳糖转移酶(NmLgtB)混合进行反应得到式(V)所示的α构型糖苷Galβ1,4GlcNAcα1,3GalNAcOR1；
优选的，三糖糖苷或二糖糖苷对应的半乳糖当量为1.2-5.0，糖苷对应的ATP当量为1.2-5.0，糖苷对应的UTP当量为1.2-5.0，MgCl2浓度为5-100mM，Tris-HCl缓冲液的浓度为10-500mM，pH5.0-10.0。


9.如权利要求7所述的Sda糖抗原的合成方法，其特征在于：Sda糖抗原核心结构和酶法模块反应的方法为将Sda糖抗原核心结构先后与唾液酸和N-乙酰氨基半乳糖、核苷酸、MgCl2、Tris-HCl缓冲液、酶法模块混合反...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹鸿志，仲侃，刘长城，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东;37