聚乙二醇化单修饰重组谷胱甘肽过氧化物酶GPX4突变体、制备方法及其应用技术

一种聚乙二醇化单修饰重组谷胱甘肽过氧化物酶GPX4突变体、制备方法及聚乙二醇化单修饰前后的重组谷胱甘肽过氧化物酶GPX4突变体在制备抗氧化药物、化妆品和保健品方面的应用，属于生物技术领域。本发明专利技术以重组谷胱甘肽过氧化物酶GPX4突变体作为待修饰蛋白，以活化的直链单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯作为修饰剂，通过共价偶联得到聚乙二醇化单修饰重组谷胱甘肽过氧化物酶GPX4突变体，其分子量约为重组谷胱甘肽过氧化物酶GPX4突变体的2倍，这有利于降低肾清除率，延长体内循环半衰期。修饰后表现出的较长半衰期、增强的药效以及较强的抗氧化活性，极大地拓宽了重组谷胱甘肽过氧化物酶GPX4突变体的应用范围。

【技术实现步骤摘要】
聚乙二醇化单修饰重组谷胱甘肽过氧化物酶GPX4突变体、制备方法及其应用
本专利技术属于生物
，涉及聚乙二醇修饰蛋白质类化合物，特别是涉及一种聚乙二醇化单修饰重组谷胱甘肽过氧化物酶GPX4突变体、制备方法及聚乙二醇化单修饰前后的重组谷胱甘肽过氧化物酶GPX4突变体在制备抗氧化药物、化妆品和保健品方面的应用。
技术介绍
谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)是生物体内一类非常重要的抗氧化酶系，属于大分子蛋白质类，在清除因物理或者化学因素造成的体内异常增多的自由基方面发挥着不可替代的作用。谷胱甘肽过氧化物酶GPX4是一种以单体形式存在的含硒蛋白，催化活性中心为硒代半胱氨酸。作为GPX家族的一员，谷胱甘肽过氧化物酶GPX4通过作用于磷脂氢过氧化物，能够减少复杂的脂质氢过氧化物与膜的结合，在维持脂质膜结构稳定中至关重要。天然谷胱甘肽过氧化物酶GPX4的来源有限，性质不稳定，为了解决这个问题，中国专利201410159032.6公开了新型高活力谷胱甘肽过氧化物酶GPX突变体及其制备方法，该制备方法通过基因突变或者合成手段，最后获得了产量高、稳定性强且酶活力高的重组谷胱甘肽过氧化物酶GPX4突变体，较强的抗氧化活性使其在制备抗氧化药物、化妆品及保健品方面具有广阔的应用前景。但是重组谷胱甘肽过氧化物酶GPX4突变体在生物体内容易经肾清除而造成体内循环半衰期较短，从而减弱抗氧化效果，为解决上述问题，使得重组谷胱甘肽过氧化物酶GPX4突变体可以得到更好的应用，我们需要对重组谷胱甘肽过氧化物酶GPX4突变体进行修饰或者改造，以达到降低肾清除率，提高生物稳定性并尽可能保持生物活性的目的。中国专利201110122788.X公开了一种修饰性谷胱甘肽过氧化物酶及其制备方法，该制备方法以猪谷胱甘肽过氧化物酶作为待修饰蛋白，以活化的直链单甲氧基聚乙二醇作为修饰剂，对该酶进行共价偶联。以直链单甲氧基聚乙二醇上游离的氯原子和该酶的氨基进行反应，氨基修饰率控制在40～45％，酶活力保持较高，但是修饰率不高。中国专利201810823075.8公开了一种聚乙二醇修饰的重组谷胱甘肽过氧化物酶GPX1突变体的制备方法，该方法以重组谷胱甘肽过氧化物酶GPX1突变体作为待修饰蛋白，以分子量为5kD的直链单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯作为修饰剂进行共价偶联，得到以稳定酰胺键存在的聚乙二醇化重组谷胱甘肽过氧化物酶GPX1突变体，但是该方法制备得到的是多修饰产物和单修饰产物的混合物质。目前还没有专利公布关于重组谷胱甘肽过氧化物酶GPX4突变体的聚乙二醇修饰工艺。在此背景下，通过聚乙二醇单修饰提高重组谷胱甘肽过氧化物酶GPX4突变体的稳定性及延长重组谷胱甘肽过氧化物酶GPX4突变体在体内的循环半衰期的研究具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术要解决的主要是重组谷胱甘肽过氧化物酶GPX4突变体因在体内的稳定性差、肾清除率高而导致的循环半衰期短，从而无法在体内充分发挥作用的问题。为解决上述问题，本专利技术的第一个目的是提供一种聚乙二醇化单修饰重组谷胱甘肽过氧化物酶GPX4突变体。本专利技术的第二个目的是提供上述聚乙二醇化单修饰重组谷胱甘肽过氧化物酶GPX4突变体的制备方法。本专利技术的第三个目的是提供上述聚乙二醇单修饰前后的该重组谷胱甘肽过氧化物酶GPX4突变体在制备抗氧化药物、化妆品和保健品方面的应用。本专利技术可以通过常规技术(如乳化、冻干等)将聚乙二醇化单修饰前后的重组谷胱甘肽过氧化物酶GPX4突变体与可药用载体或辅料制备药物组合物、化妆品或保健品，可采用多种制剂形式，可以是液体制剂、注射剂、颗粒剂、片剂、栓剂、软膏剂、气雾剂、眼用制剂、缓释控释制剂、靶向制剂等。本专利技术所述的聚乙二醇化单修饰重组谷胱甘肽过氧化物酶GPX4突变体，以重组谷胱甘肽过氧化物酶GPX4突变体(简写为：GPX4M)作为待修饰蛋白，以活化的直链单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯(mPEG-SS)作为修饰剂(购自北京健凯科技有限公司)，通过共价偶联得到聚乙二醇化单修饰重组谷胱甘肽过氧化物酶GPX4突变体(简写为：mPEG-GPX4M)，其结构式为：其中，GPX4M表示重组谷胱甘肽过氧化物酶GPX4突变体，该重组谷胱甘肽过氧化物酶GPX4突变体的制备参见中国专利201410159032.6公布的方法。mPEG表示单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯中的单甲氧基聚乙二醇部分。本专利技术还公开了上述聚乙二醇化单修饰重组谷胱甘肽过氧化物酶GPX4突变体的制备方法。修饰剂为活化的直链单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯(mPEG-SS)，共价偶联反应为待修饰蛋白的氨基和修饰剂进行共价偶联，得到稳定的酰胺键。修饰反应的反应式为：进一步的，共价偶联反应具体步骤是加入摩尔量为GPX4M1～50倍的活化的直链mPEG-SS，混匀，在4～50℃、pH6.0～9.0条件下进行10～60min的共价偶联反应，然后加入适量甘氨酸作为终止剂终止反应。由于GPX4M长时间处于较高温度和较高pH时不稳定，容易降解，而且活化的直链mPEG-SS在不同pH条件和时间时水解程度不同，因此，上述反应需要控制反应温度、反应时间和反应缓冲液pH。进一步的，所述活化的直链mPEG-SS的平均分子量为2～30kD。进一步的，所述活化的直链mPEG-SS的平均分子量为5～20kD。进一步的，所述活化的直链mPEG-SS的摩尔量是GPX4M的1～30倍。进一步的，所述活化的直链mPEG-SS的摩尔量是GPX4M的5～20倍。进一步的，所述共价偶联反应在4～20℃，pH7.5～9.0条件下进行。进一步的，所述共价偶联反应的时间为10～30min。进一步的，所述终止剂甘氨酸与活化的直链mPEG-SS的摩尔比为1：1。进一步的，最佳的反应是加入摩尔量为GPX4M20倍的活化的直链mPEG-SS(分子量为20kD)，混匀，置于4℃、pH8.5条件下反应20min进行共价偶联反应。然后加入与活化的直链mPEG-SS摩尔比1：1的甘氨酸终止反应，得到的是包含有活化的直链单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯、重组谷胱甘肽过氧化物酶GPX4突变体和聚乙二醇化单修饰重组谷胱甘肽过氧化物酶GPX4突变体的混合液。进一步的，将上述共价偶联反应所得混合液用凝胶色谱分离纯化，所使用的凝胶为本领域所公知的SephacrylS-100HR凝胶，按照说明书处理SephacrylS-100HR凝胶并填装色谱柱，使用pH7.4的20mmol/L磷酸缓冲液(含0.15mol/L氯化钠)平衡色谱柱内的SephacrylS-100HR凝胶，将体积为色谱柱柱内凝胶体积1％的上述共价偶联反应所得混合液加入已平衡的含SephacrylS-100HR凝胶的色谱柱内，当反应液刚好完全进入凝胶床面时再用1mL、pH7.4的20mmol/L磷酸缓冲液(含0.15mol/L氯化钠)洗柱内壁一次，待上述缓冲液进入凝胶床面后，用pH7.4的20mmol/L磷酸缓冲液(含0.15mol/L氯本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种聚乙二醇化单修饰重组谷胱甘肽过氧化物酶GPX4突变体，其特征在于：其结构式如下所示，/n

【技术特征摘要】
1.一种聚乙二醇化单修饰重组谷胱甘肽过氧化物酶GPX4突变体，其特征在于：其结构式如下所示，



其中，GPX4M表示重组谷胱甘肽过氧化物酶GPX4突变体，mPEG表示单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯中的单甲氧基聚乙二醇部分。


2.权利要求1所述的聚乙二醇化单修饰重组谷胱甘肽过氧化物酶GPX4突变体的制备方法，其特征在于：将活化的直链mPEG-SS和GPX4M混匀，在4～50℃、pH6.0～9.0条件下进行10～60min的共价偶联反应，然后加入甘氨酸终止反应，得到包含有活化的直链mPEG-SS、GPX4M和mPEG-GPX4M的混合液；其中，mPEG-GPX4M表示聚乙二醇化单修饰重组谷胱甘肽过氧化物酶GPX4突变体，mPEG-SS表示单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯，GPX4M表示重组谷胱甘肽过氧化物酶GPX4突变体，活化的直链mPEG-SS的摩尔量为GPX4M的1～50倍；然后将混合液用凝胶色谱分离纯化，收集含有目标产物mPEG-GPX4M的洗脱峰并进行透析除盐，将透析袋内产物冻干，即得到mPEG-GPX4M；最后通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳同时结合考蓝染色和碘染色两种染色方式鉴定目标产物。


3.如权利要求2所述的聚乙二醇化单修饰重组谷胱甘肽过氧化物酶GPX4突变体的制备方法，其特征在于：活化的直链mPEG-SS的平...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏景艳，王艳伟，闫琦，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22