本发明专利技术公开了一种天冬氨酸氧化酶突变体、工程菌及其在氧化‑还原偶联制备精草铵膦中的应用，以D,L‑草铵膦为底物，在有氧环境及过氧化氢酶存在的情况下，利用氨基酸氧化酶突变体或含有氨基酸氧化酶突变体的细胞作为生物催化剂，进行氧化反应，获得L‑草铵膦的前体酮2‑羰基‑4‑[羟基(甲基)膦酰基]丁酸。2‑羰基‑4‑[羟基(甲基)膦酰基]丁酸再在草铵膦脱氢酶的作用下，催化生成L‑草铵膦，本发明专利技术方法原料转化率和收率高，产物易于分离提纯且手性纯度较高；与其他催化工艺相比，工艺相对简单，转化率高达99％。
【技术实现步骤摘要】
天冬氨酸氧化酶突变体、工程菌及其在氧化-还原偶联制备精草铵膦中的应用(一)
本专利技术涉及生物化工领域，涉及一种精草铵膦(手性纯L-草铵膦)的生产方法；是一种利用来源于微生物的氨基酸氧化酶生产光学纯L-草铵膦的方法。(二)技术背景草铵膦(glufosinate-ammonium)化学名称为4-[羟基(甲基)膦酰基]-DL-高丙氨酸，是世界第二大转基因作物耐受除草剂，由赫斯特公司(几经合并后现归属拜耳公司)开发生产，又称草铵膦铵盐、Basta、Buster等，属膦酸类除草剂，非选择性(灭生性)触杀型除草剂是谷氨酰胺合成酶抑制剂。众所周知，灭生性除草剂市场巨大。目前，世界三大除草剂分别为百草枯，草甘膦，草铵膦。在市场使用方面，草甘膦独占鳌头，但是由于其长期使用，使得大量杂草产生抗性，而草甘膦也趋于失效；中国农业部已发布公告说明，百草枯由于其剧毒性，已被列入《鹿特丹公约》，百草枯在2014年7月1日停止生产，2016年7月1日禁止使用；全球越来越多国家禁用或限用。而目前草铵膦产量虽小，却具有优异的除草性能和较小的药害副作用，因此，在未来一段时间内拥有巨大的市场潜力。草铵膦有两种光学异构体，分别为L-草铵膦和D-草铵膦。但只有L-型具有生理活性，且在土壤中易分解，对人类和动物的毒性较小，除草谱广，对环境的破坏力小。目前，市场上销售的草铵膦一般都是外消旋混合物。若草铵膦产品能以L-构型的纯光学异构体形式使用，可显著降低草铵膦的使用量，这对于提高原子经济性、降低使用成本、减轻环境压力具有重要意义。手性纯L-草铵膦的主要制备方法主要由三种：手性拆分法，化学合成法和生物催化法。手性拆分法是通过对外消旋D,L-草铵膦或其衍生物进行手性拆分，实现D型和L型异构体的分离，从而得到光学纯的L-草铵膦。此工艺主要存在以下缺点：需要使用昂贵手性拆分试剂、理论收率只能达到50％、单次拆分率低、工艺比较复杂。化学合成法是从手性原料出发合成光学纯L-草铵膦。化学不对称合成法工艺步骤多、收率低，手性原料昂贵导致生产成本高，不利于大规模制备L-草铵膦。生物催化法生产草铵膦则具有立体选择性严格、反应条件温和、收率高等优点，是生产L-草铵膦的优势方法。主要包括以下三类：(1)以L-草铵膦的衍生物为底物，通过酶法直接水解获得，主要的优点转化率高，产物ee值较高，但需要昂贵且不易获得的手性原料作为前体，成本加高，不利于工业化生产。例如生物法制备L-草铵膦最简单的方法就是利用蛋白酶直接水解双丙氨膦。双丙氨膦是一种天然的三肽化合物，在蛋白酶的催化下，双丙氨膦脱去2分子L-丙氨酸，生成L-草铵膦。(2)以外消旋草铵膦的前提为底物，通过酶的选择性拆分获得。主要优点为原料相对易得，催化剂活力高，但其理论收率只能达到50％，会造成原料的浪费。例如一种采用α-胰凝乳蛋白酶拆分双丙氨膦乙酯制备L-草铵膦的方法，该法首先经过3步反应将外消旋的草铵膦合成双丙氨膦二乙酯，接着用碱性mesinterico肽酶将其C端脂基水解。再经α-胰凝乳蛋白酶催化水解肽键。在该步反应中，α-胰凝乳蛋白酶能选择性水解L-双丙氨膦乙酯，生成L-草铵膦乙脂。最后利用磷酸二脂酶水解P端酯基得到L-草铵膦。(3)以α-酮酸(2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸)为底物，通过酶的不对称合成获得，主要涉及的酶包括转氨酶与氨基酸氧化酶。早在研究草铵膦在土壤微生物体内的代谢途径时就已经发现，L-草铵膦在转氨酶的作用下，发生转氨作用被分解成一种α-酮酸(2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸，简称PPO)。SchμLzA等(Stereospeciricproductionortheherbicidephosphinothricin(glurosinate)bytransamination:isolationandcharacterizationoraphosphinothricin-specirictransaminasefromEscherichiacoli[J].Applied&EnvironmentalMicrobiology,1990,56(1):1-6.)在上世纪90年代就利用从大肠杆菌中克隆的转氨酶，以2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸为底物，L-谷氨酸作为氨基供体，催化转氨反应生产L-草铵膦。该在转氨酶经固定化并安装至生物反应器，催化制备L-草铵膦，其产物浓度可达76.1g/L，最高产率为50g/(L·h)，L-草铵膦的ee值超过99.9％。但利用转氨酶制备L-草铵膦有两大缺陷，其一是原料PPO不能完全转化为L-PPT，转化率最高只有90％；其二是要使可逆反应向生成L-PPT的方向进行，需要4倍当量以上的L-谷氨酸作为氨基供体，过量的谷氨酸给L-草铵膦的分离带来了很大的麻烦。(4)以D,L-草铵膦为原料，其中的D-草铵膦经D-氨基酸氧化酶催化得到L-草铵膦前体酮2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸，再经草铵膦脱氢酶催化得到L-草铵膦，该方法不仅解决了消旋化的问题，也节约了成本。D-氨基酸氧化酶是一类特异选择性的将D-氨基酸及其衍生物催化生成α-酮酸的酶，反应由其本身自带的辅酶FAD催化完成，因其表现处的优良催化效率和选择性，D-氨基酸氧化酶被广泛用于生物拆分L-氨基酸和α酮酸的生产。例如，D-氨基酸氧化酶转化头孢菌素C为戊二酰-7-氨基头孢烯酸。氨基酸脱氢酶(EC1.4.1.-，AADH)是一类能将氨基酸可逆的脱氨生成对应酮酸的酶，其反应需要核苷类辅酶的参与(NAD(P)+)。因其表现出的优良催化效率与选择性，氨基酸脱氢酶被广泛的应用于还原胺化生成天然与非天然α-氨基酸中。前期通过挖掘到的谷氨酸脱氢酶经过改造后催化2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸生成L-草铵膦具有较高活力，因此命名为草铵膦脱氢酶。在诸多草铵膦的酶法合成路线中，酮酸中间体的酮羰基是潜手性官能团，能够通过酶法合成途径构建手性中心，酮酸路线也因原料价廉易得且可以避免使用剧毒氰化物，而成为适宜L-草铵膦工业化开发生产的路线。
技术实现思路
本专利技术提供了一种天冬氨酸氧化酶突变体、包含天冬氨酸氧化酶突变体的基因工程菌以及在制备精草铵膦(L-草铵膦)中的应用，该天冬氨酸氧化酶突变体对催化活性进行改造，活力有了较大提升，将突变体进一步的组合，获得高活力菌株，转化率高、收率高、产物易于分离提纯且显著缩短了反应进程。本专利技术采用的技术方案如下：本专利技术提供了一种天冬氨酸氧化酶突变体，所述天冬氨酸氧化酶突变体是将SEQIDNO.2所示氨基酸序列第16、34、50、54、57、58、210、219、312或313位氨基酸进行单突变或多突变获得的。进一步，优选所述天冬氨酸氧化酶突变体是将SEQIDNO.2所示氨基酸序列第16位异亮氨酸突变为苯丙氨酸、第54位精氨酸突变为组氨酸、第57位酪氨酸突变为天冬酰胺、第219位精氨酸突变为赖氨酸且第312位天冬酰胺突变为组氨酸，氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种天冬氨酸氧化酶突变体，其特征在于所述天冬氨酸氧化酶突变体是将SEQ IDNO.2所示氨基酸序列第16、34、50、54、57、58、210、219、312或313位氨基酸进行单突变或多突变获得的。/n
【技术特征摘要】
1.一种天冬氨酸氧化酶突变体，其特征在于所述天冬氨酸氧化酶突变体是将SEQIDNO.2所示氨基酸序列第16、34、50、54、57、58、210、219、312或313位氨基酸进行单突变或多突变获得的。
2.如权利要求1所述天冬氨酸氧化酶突变体，其特征在于所述氨基酸氧化酶突变体是将SEQIDNO.2所示氨基酸序列第16位异亮氨酸突变为苯丙氨酸、第54位精氨酸突变为组氨酸、第57位酪氨酸突变为天冬酰胺、第219位精氨酸突变为赖氨酸且第312位天冬酰胺突变为组氨酸。
3.一种权利要求1所述天冬氨酸氧化酶突变体在氧化-还原偶联制备L-草铵膦中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述的应用为：以含天冬氨酸氧化酶突变体基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以D,L-草铵膦为底物，加入过氧化氢酶，以pH值7.0-8.0的磷酸缓冲液为反应介质构成反应体系，在30℃、通气量1-3L/min、600rpm下进行反应，再加入作为辅助催化剂的含草铵膦脱氢酶突变体基因和葡萄糖脱氢酶基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体、葡萄糖和无机氨基供体，在30℃、600rpm下反应完全后，获得含L-草铵膦的反应液，反应液分离纯化，获得L-草铵膦；所述草铵膦脱氢酶突变体基因编码蛋白氨基酸序列为SEQIDNO.5所示；所述葡萄糖脱氢酶基因编码蛋白氨基酸序列为SEQIDNO.6所示。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述无机氨基供体为硫酸铵。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述催化剂加入量以反应体系体积计为10-30g/L；所述底物加入量以反应体系体积计为200-800mM，所述过氧化氢酶加入量以反应体系体积计为30-50万U/L。
7.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述辅助催化剂加入量以反应体系体积计为10-30g/L，所述葡萄糖加入量以反应体系体积计为100-500mM，所述无机氨基供体加入量以...
【专利技术属性】
技术研发人员：程峰，张铧月，薛亚平，徐建妙，沈其，邹树平，郑裕国，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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