一种三磷酸化合物和脱氧核苷酸的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种三磷酸化合物和脱氧核苷酸的制备方法。本发明专利技术的三磷酸化合物制备方法通过用四氢呋喃替代磷酸三甲酯/磷酸三乙酯、三正丙基胺替代三正丁基胺、乙腈替代N,N‑二甲基甲酰胺，具有产率大、副产物少、溶剂易去除、无毒安全等优点。本发明专利技术的脱氧核苷酸方法通过用吗啉‑二甲基甲酰胺溶液替代三乙胺溶液来脱除‑Fmoc基团，大幅缩短了反应时间，减少了副产物的生成，提高了产率。

【技术实现步骤摘要】
一种三磷酸化合物和脱氧核苷酸的制备方法
本专利技术涉及一种三磷酸化合物和脱氧核苷酸的制备方法，属于有机合成

技术介绍
末端脱氧核苷酸转移酶是一种无需模板的DNA聚合酶，用于催化脱氧核苷酸结合到DNA分子的3'羟基端，在人类和动物的免疫反应形成过程中起重要作用。2'-脱氧核苷-5'-三磷酸是末端脱氧核苷酸转移酶的天然底物，不过有研究发现是否存在核苷片段并不影响三磷酸酯作为底物的性质，即三磷酸类化合物可以替代2'-脱氧核苷-5'-三磷酸用作某些末端脱氧核苷酸转移酶(例如：小牛胸腺末端脱氧核苷酸转移酶)的底物。然而，文献报道的三磷酸类化合物合成方法普遍的反应收率仅有7％～12％，且还需要使用三正丁基胺这种一类剧毒品，所以无法大规模推广应用。核苷酸是一类由嘌呤碱或嘧啶碱、核糖或脱氧核糖以及磷酸三种物质组成的化合物。核苷酸最常见的修饰手段是在5位标记荧光染料分子或者在7位碱基上修饰一些可用于检测的基团，用于各种基因组学，包括DNA标记和测序，而7位碱基上修饰的分子在与DNA聚合酶发生作用后，这些带标记核苷酸就会插入延伸的DNA链当中，导致新的DNA结构发生变化。近些年，研究人员在研究单分子测序时发现5位修饰亦可用于DNA测序，而此类修饰一般是延伸5位磷酸酯键并甩出一个容易与一些标记分子连接的官能团，例如-NH2等，因此这类化合物的合成研究对单分子测序至关重要，其多样性能够增加单分子测序底物筛选的样本量，为优化筛选测序底物提供更多的可能性。然而，文献报道的通过三磷酸类化合物合成核苷酸的方法普遍存在目标产物收率较低、副产物多、制备周期长、溶剂难去除等问题，无法大规模推广应用。因此，有必要开发一种收率更高、更加安全的三磷酸化合物合成方法，并进一步利用三磷酸化合物来合成脱氧核苷酸。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种三磷酸化合物和脱氧核苷酸的制备方法。本专利技术所采取的技术方案是：一种三磷酸化合物的制备方法，包括以下步骤：1)将芴甲氧羰酰氯和分散在溶剂中，X为C2～C9的亚烷基，再加入Na2CO3溶液，常温反应，萃取，析晶，得到2)将三氯氧磷和分散在四氢呋喃中，30～50℃反应，得到3)将焦磷酸三正丙基铵盐的乙腈溶液和三正丙基胺加入步骤2)的反应液中，室温反应，得到4)将三乙胺-碳酸缓冲液加入步骤3)的反应液中，室温反应，浓缩，得到三磷酸化合物粗品；5)通过反相高效液相色谱对三磷酸化合物粗品进行纯化，得到三磷酸化合物优选的，步骤1)所述芴甲氧羰酰氯、的摩尔比为(1.1～1.5)：1。优选的，步骤1)所述溶剂为1,4-二氧六环、乙腈、二甲基甲酰胺、二氯甲烷中的至少一种。优选的，步骤1)所述Na2CO3溶液的质量分数为5％～15％。优选的，步骤1)所述反应的时间为10～15h。优选的，步骤2)所述三氯氧磷、的摩尔比为(1.2～2.1)：1。优选的，步骤2)所述反应的时间为3～5h。优选的，步骤2)所述步骤3)所述焦磷酸三正丙基铵盐的摩尔比为1：(5～8)。优选的，步骤2)所述步骤3)所述三正丙基胺的摩尔比为1：(5～8)。优选的，步骤3)所述反应的时间为1～2h。优选的，步骤4)所述反应的时间为20～50h。一种脱氧核苷酸的制备方法，包括以下步骤：1)将和N,N'-羰基二咪唑分散在溶剂中，X为C2～C9的亚烷基，室温反应，再加入甲醇，室温反应，得到2)将2'-脱氧核苷-5'-多磷酸酯的三正丁基铵盐溶于溶剂后加入步骤1)的反应液中，再加入MgCl2，室温反应，旋蒸，得到Y为A、G、C、T四种碱基中的一种，n为1～4的自然数；3)将加入吗啉-二甲基甲酰胺溶液中，室温反应，浓缩，得到脱氧核苷酸粗品；4)通过反相高效液相色谱对脱氧核苷酸粗品进行纯化，得到脱氧核苷酸优选的，步骤1)所述N,N'-羰基二咪唑、甲醇的摩尔比为1：(2～5)：(4～7)。优选的，步骤1)所述溶剂为二甲基甲酰胺、乙腈、二甲基亚砜中的至少一种。优选的，步骤1)中第一次反应的时间为3～5h，第二次反应的时间为20～40min。优选的，步骤1)所述步骤2)所述2'-脱氧核苷-5'-多磷酸酯的三正丁基铵盐、步骤2)所述MgCl2的摩尔比为1：(1.1～1.5)：(8～20)。优选的，步骤2)所述反应的时间为10～20h。优选的，步骤3)所述反应的时间为2～3h。本专利技术的有益效果是：本专利技术的三磷酸化合物制备方法具有产率高、副产物少、溶剂易去除、无毒安全等优点，由该三磷酸化合物制备脱氧核苷酸的方法具有反应时间短、副产物少、产率高等优点，均适合进行大规模推广应用。具体来说：1)本专利技术的三磷酸化合物制备方法的收率大于40％，约为传统方法的4倍，本专利技术的脱氧核苷酸制备方法的收率大于80％，而传统方法低于60％；2)本专利技术用四氢呋喃替代磷酸三甲酯/磷酸三乙酯作为溶剂进行三氯氧磷和的反应，有效减少了二磷酸甲酯化副产物的生成，最终提高了三磷酸化合物的产率；3)本专利技术用三正丙基胺替代三正丁基胺(一类剧毒品)与反应，更加安全；4)本专利技术用乙腈替代N,N-二甲基甲酰胺来分散焦磷酸三正丙基铵盐，反应结束后溶剂更加容易去除；5)本专利技术用吗啉-二甲基甲酰胺溶液替代三乙胺溶液来脱除-Fmoc基团，大幅缩短了反应时间，减少了副产物的生成，提高了脱氧核苷酸的产率。附图说明图1为实施例1步骤4)中的三磷酸化合物粗品的液相色谱图。图2为实施例1中的N-(9-芴基甲氧羰基)-6-氨基己基三磷酸的核磁共振氢谱图。图3为实施例1中的N-(9-芴基甲氧羰基)-6-氨基己基三磷酸的核磁共振磷谱图。图4为实施例1中的dA6P-NH2-Nucleotides的核磁共振氢谱图。图5为实施例1中的dA6P-NH2-Nucleotides的核磁共振磷谱图。图6为实施例2中的dA4P-NH2-Nucleotides的核磁共振氢谱图。图7为实施例2中的dA4P-NH2-Nucleotides的核磁共振磷谱图。图8为实施例3中的dT4P-NH2-Nucleotides的核磁共振氢谱图。图9为实施例3中的dT4P-NH2-Nucleotides的核磁共振磷谱图。图10为实施例4中的N-(9-芴基甲氧羰基)-2-氨基乙基三磷酸的核磁共振氢谱图。图11为实施例4中的N-(9-芴基甲氧羰基)-2-氨基乙基三磷酸的核磁共振磷谱图。图12为对比例步骤4)中的三磷酸化合物粗品的液相色谱图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的解释和说明。实施例1：N-(9-芴基甲氧羰基)-6-氨基己基三磷酸的合成：1)将5.3g的芴甲氧羰酰氯溶于40mL的1,4-二氧六环，在0℃下加入2g的6-氨基-1-己本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种三磷酸化合物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：/n1)将芴甲氧羰酰氯和

【技术特征摘要】
1.一种三磷酸化合物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)将芴甲氧羰酰氯和分散在溶剂中，X为C2～C9的亚烷基，再加入Na2CO3溶液，常温反应，萃取，析晶，得到
2)将三氯氧磷和分散在四氢呋喃中，30～50℃反应，得到
3)将焦磷酸三正丙基铵盐的乙腈溶液和三正丙基胺加入步骤2)的反应液中，室温反应，得到
4)将三乙胺-碳酸缓冲液加入步骤3)的反应液中，室温反应，浓缩，得到三磷酸化合物粗品；
5)通过反相高效液相色谱对三磷酸化合物粗品进行纯化，得到三磷酸化合物


2.根据权利要求1所述的三磷酸化合物的制备方法，其特征在于：步骤1)所述芴甲氧羰酰氯、的摩尔比为(1.1～1.5)：1。


3.根据权利要求1或2所述的三磷酸化合物的制备方法，其特征在于：步骤1)所述溶剂为1,4-二氧六环、乙腈、二甲基甲酰胺、二氯甲烷中的至少一种。


4.根据权利要求1所述的三磷酸化合物的制备方法，其特征在于：步骤2)所述三氯氧磷、的摩尔比为(1.2～2.1)：1。


5.根据权利要求1或4所述的三磷酸化合物的制备方法，其特征在于：步骤2)所述步骤3)所述焦磷酸三正丙基铵盐的摩尔比为1：(5～8)。


6.根据权利要求1或4所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦龙，杨照亮，何筠，田晖，
申请(专利权)人：深圳清华大学研究院，安序源生物科技深圳有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44