一种鹅星状病毒二价灭活疫苗和卵黄抗体及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种鹅星状病毒二价灭活疫苗和卵黄抗体及其制备方法，鹅星状病毒二价灭活疫苗通过将鹅星状病毒1型、2型毒株分别接种于驯化好的LMH细胞进行悬浮培养得到病毒含量高，无需浓缩的病毒液，将病毒液灭活后和疫苗佐剂混合乳化获得，鹅星状病毒二价卵黄抗体通过使用灭活疫苗对产蛋鸡进行免疫获得的高免疫鸡蛋，分离卵黄提取抗体获得。本发明专利技术中制备的鹅星状病毒二价灭活疫苗和卵黄抗体对雏鹅能够提供有效的免疫保护，能够有效的预防鹅痛风的发生，具有很好的商品化开发前景。

【技术实现步骤摘要】
一种鹅星状病毒二价灭活疫苗和卵黄抗体及其制备方法
本专利技术属于疫苗抗体制备领域，具体地说涉及一种鹅星状病毒二价灭活疫苗和卵黄抗体及其制备方法。
技术介绍
自2016年以来，河南、江苏、山东等十余省份鹅场爆发了以内脏和关节痛风为主要特征的传染性疾病，给鹅场造成了严重的经济损失。该病主要侵害3周龄以下雏鹅，最早可见1日龄雏鹅发病，死亡率20％～70％，患病鹅通常表现为精神沉郁、饮食减少、卧地不起、不愿走动，有白色稀粪排出，剖检表现为肾脏、心脏、肝脏、肺脏、输尿管、关节等有大量尿酸盐沉积。该病在使用不同饲料、不同药物的不同品种鹅群中均有发生，降低饲料中的蛋白含量、减少饲喂量均无效。文献报道及实验室病原检测表明，雏鹅痛风病主要有2种不同基因型的鹅星状病毒导致，分别为鹅1型星状病毒和鹅2型星状病毒。序列比对分析发现，1型和2型鹅星状病毒毒株之间的序列同源性较低(<70％)；血清中和试验表明，1型和2型毒株相互之间缺乏有效的交叉保护。目前对鹅星状病毒的培养多采用鹅胚或鹅胚肾细胞进行培养，但鹅胚具有成本高、来源有限、病毒含量低，无SPF鹅胚、易有外源因子污染的缺点；鹅胚肾细胞制备繁琐、量少、易受污染，因此，鹅胚或鹅胚肾细胞均不利于大规模生产。鹅星状病毒的培养存在诸多困难，严重制约了疫苗及相关产品的开发，且目前国内外尚无有效预防和治疗该病的商品化的二价灭活疫苗和抗体，因此，研制包含鹅1型、2型星状病毒的二价灭活疫苗和抗体是预防和控制鹅星状病毒的必然要求。
技术实现思路
针对现有技术的种种不足，为了解决上述问题，现提出一种鹅星状病毒二价灭活疫苗及卵黄抗体的制备方法。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种鹅星状病毒二价灭活疫苗的制备方法，包括如下步骤：(1)选取两株不同的鹅星状病毒，两株不同的鹅星状病毒均采用LMH细胞培养的方式进行增殖，LMH细胞培养的方法为，将鹅星状病毒在LMH细胞中进行培养增殖后收获病毒液，收获的病毒液经LMH细胞连续接毒传代，直至收获的病毒液中鹅星状病毒的病毒含量大于等于106.0TCID50/0.1ml，取该代次的病毒液接种于驯化好的LMH细胞中进行悬浮培养增殖，收获病毒液；(2)将两株不同的鹅星状病毒分别采用LMH细胞培养增殖最终获得的病毒液分别灭活，然后将两种分别灭活的病毒液和疫苗佐剂混合乳化即获得鹅星状病毒二价灭活疫苗。优选的,两株不同的鹅星状病毒分别为鹅1型星状病毒和鹅2型星状病毒，两株不同的鹅星状病毒之间没有血清学关系。优选的,两株不同的鹅星状病毒为保藏编号为CCTCCNo.V202047的新型鹅星状病毒WF株和保藏编号为CCTCCNo.V201820的新型鹅星状病毒GD0122株，新型鹅星状病毒WF株和新型鹅星状病毒GD0122株之间没有血清学关系。优选的,步骤(1)中用于接种于LMH细胞中的鹅1型星状病毒和鹅2型星状病毒由以下方法获得：(A)将鹅1型星状病毒和鹅2型星状病毒的病毒液接种于12～13日龄的鹅胚中，收获24～168小时死亡的鹅胚尿囊液和168小时存活的鹅胚尿囊液，以此方式连续传代3代；(B)对连续传代3代后收获的病毒液进行病毒鉴定，对符合要求的病毒液接种于12～13日龄的鹅胚中，收获24～168小时死亡的鹅胚尿囊液和168小时存活的鹅胚尿囊液，以此方式在12～13日龄鹅胚中继续传3代。优选的，在步骤(1)的LMH细胞培养的方法中经纯化的鹅星状病毒接种于LMH细胞中，37℃，5％CO2条件下进行培养，培养增殖后收获病毒液，收获的病毒液经LMH细胞连续接毒传3～6代，直至80％的LMH细胞出现病变且病变时间控制在72～96小时内，收获病毒液，定为F1代，将收获的F1代病毒液按照同样的方法在LMH细胞中继续繁毒5～10代，分别测定各代次病毒含量，取鹅星状病毒的病毒含量大于等于106.0TCID50/0.1ml代次的病毒液接种于驯化好的LMH细胞中进行悬浮培养增殖，收获病毒液。一种鹅星状病毒二价灭活疫苗，由上述的鹅星状病毒二价灭活疫苗的制备方法制备得到。优选的,所述鹅1型星状病毒和鹅2型星状病毒的病毒含量均不低于107.0TCID50/0.1ml。一种鹅星状病毒二价卵黄抗体，由上述的鹅星状病毒二价灭活疫苗免疫产蛋鸡获得。一种鹅星状病毒二价卵黄抗体的制备方法，包括如下步骤：(a)用上述的鹅星状病毒二价灭活疫苗对产蛋鸡进行免疫；(b)利用步骤(a)获得的高免疫鸡蛋，分离卵黄，提取抗体。优选的,步骤(a)的具体方法为：基础免疫：向每只鸡胸部肌肉注射鹅星状病毒二价灭活疫苗0.5ml；二次免疫：在基础免疫后第14日进行第2次接种，向每只鸡胸部肌肉注射鹅星状病毒二价灭活疫苗1.0ml；三次免疫：在二次免疫后第14日进行第3次接种，向每只鸡胸部肌肉注射鹅星状病毒二价灭活疫苗1.0ml；维持免疫：当卵黄中鹅1型星状病毒和鹅2型星状病毒的琼扩抗体效价均达到1:96时，维持接种1次，向每只鸡胸部肌肉注射鹅星状病毒二价灭活疫苗1.0ml；收蛋：三次强化免疫10日后，抽样取蛋，分离卵黄，提取抗体，鹅1型星状病毒和鹅2型星状病毒的琼扩抗体效价大于等于1:64为合格，收集高免疫鸡蛋；步骤(b)的具体方法为：将步骤(a)获得的高免疫鸡蛋的蛋黄液加入巴氏灭菌罐中，加入注射用水，搅拌混匀后，加热至65℃，保温灭活15分钟，灭活结束后，水浴冷却至30℃以下；于酸化反应罐中加入相当于原蛋黄体积4倍的注射用水，用1mol/LHCl溶液调节pH值至4.2，并将水温降至2～4℃，然后，将灭活的蛋黄液加入，边加边搅拌，4～8℃保温静置4小时；将酸化萃取液冷冻离心，去沉淀，取上清液备用；在上清液加入辛酸至终浓度0.02％，搅拌混匀，室温放置4小时，用K型多层板框过滤澄清，按终浓度0.05％加入甲醛溶液，充分搅拌混匀，密封60分钟，后用截留分子量为1000KD的超滤膜过滤除病毒；加入吐温-80至终浓度0.02％，用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值6.8，将调配合格的抗体用0.22μm微孔滤膜进行过滤除菌后即获得雏鹅痛风精制卵黄抗体。有益效果：(1)本专利技术将鹅星状病毒1型、2型毒株均接种于驯化好的LMH细胞进行悬浮培养，得到的病毒含量高，无需浓缩可直接用于疫苗制备，具有无外源因子污染、易于规模化生产、生产线占用空间小、生产效率高、成本低、能较好的维持病毒抗原稳定等优点，克服了用鹅胚、鹅胚肾细胞、细胞瓶培养的缺点。(2)本专利技术所筛选的病毒，经悬浮培养制备的鹅星状病毒1型和2型二价灭活疫苗安全性良好，未出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应，经过性状、安全性试验、效力试验数据的分析，各项指标均稳定有效；利用血清学方法和免疫攻毒法评估疫苗的免疫效果，结果显示，本专利技术中制备的鹅星状病毒1型和2型二价灭活疫苗对雏鹅能够提供有效的免疫保护，能够有效的预防雏鹅痛风的发生，具有很好的商品化开发前景。(3)本发本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鹅星状病毒二价灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：/n(1)选取两株不同的鹅星状病毒，两株不同的鹅星状病毒均采用LMH细胞培养的方式进行增殖，LMH细胞培养的方法为，将鹅星状病毒在LMH细胞中进行培养增殖后收获病毒液，收获的病毒液经LMH细胞连续接毒传代，直至收获的病毒液中鹅星状病毒的病毒含量大于等于10

【技术特征摘要】
1.一种鹅星状病毒二价灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)选取两株不同的鹅星状病毒，两株不同的鹅星状病毒均采用LMH细胞培养的方式进行增殖，LMH细胞培养的方法为，将鹅星状病毒在LMH细胞中进行培养增殖后收获病毒液，收获的病毒液经LMH细胞连续接毒传代，直至收获的病毒液中鹅星状病毒的病毒含量大于等于106.0TCID50/0.1ml，取该代次的病毒液接种于驯化好的LMH细胞中进行悬浮培养增殖，收获病毒液；
(2)将两株不同的鹅星状病毒分别采用LMH细胞培养增殖最终获得的病毒液分别灭活，然后将两种分别灭活的病毒液和疫苗佐剂混合乳化即获得鹅星状病毒二价灭活疫苗。


2.根据权利要求1所述的鹅星状病毒二价灭活疫苗的制备方法，其特征在于，两株不同的鹅星状病毒分别为鹅1型星状病毒和鹅2型星状病毒，两株不同的鹅星状病毒之间没有血清学关系。


3.根据权利要求2所述的鹅星状病毒二价灭活疫苗的制备方法，其特征在于，两株不同的鹅星状病毒为保藏编号为CCTCCNo.V202047的新型鹅星状病毒WF株和保藏编号为CCTCCNo.V201820的新型鹅星状病毒GD0122株，新型鹅星状病毒WF株和新型鹅星状病毒GD0122株之间没有血清学关系。


4.根据权利要求2所述的鹅星状病毒二价灭活疫苗的制备方法，其特征在于，步骤(1)中用于接种于LMH细胞中的鹅1型星状病毒和鹅2型星状病毒由以下方法获得：
(A)将鹅1型星状病毒和鹅2型星状病毒的病毒液接种于12～13日龄的鹅胚中，收获24～168小时死亡的鹅胚尿囊液和168小时存活的鹅胚尿囊液，以此方式连续传代3代；
(B)对连续传代3代后收获的病毒液进行病毒鉴定，对符合要求的病毒液接种于12～13日龄的鹅胚中，收获24～168小时死亡的鹅胚尿囊液和168小时存活的鹅胚尿囊液，以此方式在12～13日龄鹅胚中继续传3代。


5.根据权利要求2-4任意一项所述的鹅星状病毒二价灭活疫苗的制备方法，其特征在于，在步骤(1)的LMH细胞培养的方法中经纯化的鹅星状病毒接种于LMH细胞中，37℃，5％CO2条件下进行培养，培养增殖后收获病毒液，收获的病毒液经LMH细胞连续接毒传3～6代，直至80％的LMH细胞出现病变且病变时间控制在72～96小时内，收获病毒液，定为F1代，将收获的F1代病毒液按照同样的方法在LMH细胞中继续繁毒5～10代，分别测定各代次病毒含量，取鹅星状病毒的病毒含量大于等于106.0TCID50/0.1ml代次的病毒液接种于驯化好...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐丽娜，罗济冠，常娓娓，王学波，郭春丽，刘宁，李朝阳，
申请(专利权)人：山东信得科技股份有限公司，青岛信得药业有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37