基于偏振结构光调制的多维层析荧光显微成像系统及方法技术方案

本发明专利技术公开了一种基于偏振结构光调制的多维层析荧光显微成像系统及方法。本发明专利技术对每个偏振调制方向的照明，都采集两张相位互补的正弦结构光照明图案，通过这两张正弦结构光照明图案的平均来获取均匀光照明图案，再将该均匀光照明图案与其中一张正弦结构光照明图案结合并利用HiLo算法即可求解出光学层析图像；只需要对这三张结构光图案平均同样可以得到均匀光照明图案，再与其中一张结构光照明图案结合即可利用HiLo算法求解出光学层析图案；本发明专利技术采取了探测端分光同时采集的方法，不需要增加额外的采集时间；本发明专利技术成像速度、较少光漂白等方面具有较大的优势。

【技术实现步骤摘要】
基于偏振结构光调制的多维层析荧光显微成像系统及方法
本专利技术涉及光学显微成像领域，具体涉及一种基于偏振结构光调制的多维层析荧光显微成像系统及方法。
技术介绍
荧光显微成像可以对生物样本进行非侵入、特异性的观测，其在亚细胞结构功能的研究等领域具有十分重要的意义。荧光的基本物理属性包括荧光强度、偏振、光谱以及荧光寿命等，尽可能多地探测这些物理属性可以获取细胞内部更为多样的信息。本专利技术提出的方法可以探测荧光的强度、光谱以及偏振等多维信息。本专利技术在照明端采用偏振调制照明，通过不少于三个偏振方向的调制照明，可以解出样本的偏振信息；在探测端则利用二向色镜将荧光不同谱段的信号在光路上分开，并同时投射到相机的不同位置，以便实现对多个谱段信号的同时采集。在传统的宽场荧光显微中，样本在一个三维体积内的荧光都会被激发，所以背景信号将会和焦平面信号混叠在一起被探测，使得偏振、光谱等信息的探测出现偏离。其中一种解决方案是采用荧光共聚焦显微技术，但该技术需要通过点扫描实现二维成像，需要成百上千次探测，极大降低了成像速度。
技术实现思路
针对以上现有技术中存在的问题，本专利技术提出了一种基于偏振结构光调制的多维层析荧光显微成像系统及方法；针对荧光多维信息的采集，本专利技术除了可以探测强度外，通过在照明端引入偏振调制照明实现荧光偏振解析，通过在探测端分谱段同时采集实现荧光光谱信息探测；针对背景噪声对焦面信号的干扰，本方法通过引入HiLo技术来减小荧光背景噪声，以便提升强度、光谱、偏振等信息测量的准确性。本专利技术的一个目的在于提出一种基于偏振结构光调制的多维层析荧光显微成像系统。本专利技术的基于偏振结构光调制的多维层析荧光显微成像系统包括：多个激光器、合束装置、声光可调谐滤波器、扩束装置、偏振分光器、半波片、空间光调制器、聚光透镜、空间滤光器、涡旋半波片、第一二向色镜、第一4f系统、第二二向色镜、物镜、发射滤光片、镜筒透镜、第二4f系统、光阑、波段分光装置和相机；其中，每一个激光器发出一个波段的线偏振激光，多个激光器分别发出不同波段的线偏振激光；多束不同波段的线偏振激光经合束装置合束，同光轴传输至声光可调谐滤波器；通过声光可调谐滤波器快速选择通过的线偏振激光的波段；选定波段的线偏振激光经扩束装置进行扩束，经偏振分光器和半波片至空间光调制器；在空间光调制器上加载周期性的黑白相间的二值周期条纹，激光被反射后形成多级线偏振衍射光，空间光调制器的平面垂直于光轴；多级线偏振衍射光再经半波片和偏振分光器出射，先后两次经过偏振分光器和半波片，保证从偏振分光器出射的多级线偏振衍射光的偏振方向与入射的线偏振激光的偏振方向一致；多级线偏振衍射光经聚光透镜聚焦后至空间滤光器；聚光透镜的焦平面位于空间光调制器的傅里叶面，空间滤光器位于聚光透镜的焦平面处；多级线偏振衍射光经空间滤光器后只有±1级线偏振衍射光通过；再经过紧邻空间滤光器放置的涡旋半波片将±1级线偏振衍射光的偏振方向调节为与空间光调制器上的二值周期条纹的方向一致；±1级线偏振衍射光经第一二向色镜后通过第一4f系统，再经第二二向色镜，由物镜汇聚至位于物镜后焦面的样本上，第一4f系统将空间光调制器的傅里叶面延迟到物镜的后焦面，即通过第一4f系统使得物镜的后焦面位于空间光调制器的傅里叶面；±1级线偏振衍射光在物镜的后焦面上干涉形成正弦条纹照明，激发样本产生荧光，荧光返回后由物镜收集，经第二二向色镜后，通过发射滤光片滤波，再由镜筒透镜聚焦；第一二向色镜与第二二向色镜完全相同，但空间放置方向互相垂直，从而消除单独使用第二二向色镜引入的偏振畸变；在镜筒透镜与相机之间设置第二4f系统，从而将镜筒透镜的焦平面延迟到相机所在的平面；在第二4f系统中间首先放置光阑,用来控制成像视场的大小；在第二4f系统中间，光阑之后设置波段分光装置，波段分光装置将荧光按照波段从空间上分开，从而将不同波段荧光投射到相机不同的位置，荧光的每一个波段对应相机上的一个位置，作为一个光谱探测通道；相机通过不同位置采集相应波段的荧光，得到一张原始图像；保持二值周期条纹的角度不变，将空间光调制器上加载的二值周期条纹变成互补的二值周期条纹，再得到一张原始图像，从而得到二值周期条纹在一个角度下的两张原始图像，构成一组原始图像；二值周期条纹绕着水平的光轴旋转，每旋转π/n获得一组原始图像，n≥3，从而得到n组原始图像；对每一组原始图像按照不同的光谱探测通道进行层析图像重建得到n张层析图像，并将n张层析图像平均，得到每个光谱探测通道对应的宽场光学层析图像，进而得到光谱相关的信息；对这n张层析图像进行偏振解调，得到偏振相关的信息。合束装置采用反射镜和二向色镜。第一4f系统和第二4f系统即为光学平面延迟缩放4f系统，就是将一个光学平面传递到另外一个位置，并进行缩放。扩束装置采用4f系统。空间滤光器与二值周期条纹的旋转角度相对应，包括n对通光孔，每一对通光孔位于一条通过圆形的直径上，相邻的每对通光孔之间的夹角为π/n。波段分光装置采用m-1个二向色镜，将荧光分成m个波段，每一个波段上设置一个或多个反射镜，从而调节相应波段的荧光的光路的空间位置，形成m个光谱探测通道。本专利技术的另一个目的在于提出一种基于偏振结构光调制的多维层析荧光显微成像方法。本专利技术的基于偏振结构光调制的多维层析荧光显微成像方法，包括以下步骤：1)每一个激光器发出一个波段的线偏振激光，多个激光器分别发出不同波段的线偏振激光；2)多束不同波段的线偏振激光经合束装置合束，同光轴传输至声光可调谐滤波器；通过声光可调谐滤波器快速选择通过的线偏振激光的波段；3)选定波段的线偏振激光经扩束装置进行扩束，经偏振分光器和半波片至空间光调制器；4)在空间光调制器上加载周期性的黑白相间的二值周期条纹，激光被反射后形成多级线偏振衍射光，空间光调制器平面垂直于水平光轴；5)多级线偏振衍射光再经半波片和偏振分光器出射，线偏振激光先后两次经过偏振分光器和半波片，保证从偏振分光器出射的多级线偏振衍射光的偏振方向与入射的线偏振激光的偏振方向一致；6)多级线偏振衍射光经聚光透镜聚焦后至空间滤光器；聚光透镜的焦平面位于空间光调制器的傅里叶面，空间滤光器位于聚光透镜的焦平面处；多级线偏振衍射光经空间滤光器后只有±1级线偏振衍射光通过；7)±1级线偏振衍射光经过紧邻空间滤光器放置的涡旋半波片，将±1级线偏振衍射光的偏振方向调节为与空间光调制器上的二值周期条纹的方向一致；8)±1级线偏振衍射光经第一二向色镜后通过第一4f系统，再经第二二向色镜，由物镜汇聚至位于物镜后焦面的样本上，第一4f系统将空间光调制器的傅里叶面延迟到物镜的后焦面，即通过第一4f系统使得物镜的后焦面位于空间光调制器的傅里叶面；9)±1级线偏振衍射光在物镜的后焦面上干涉形成正弦条纹照明，激发样本产生荧光，荧光返回后由物镜收集，经第二二向色镜后，通过发射滤光片滤波，再由镜筒透镜聚焦；第一二向色镜与第二二向色镜完全相同，但空间放置方向互相垂直，从而消除单独使用第二二向色镜本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于偏振结构光调制的多维层析荧光显微成像系统，其特征在于，所述多维层析荧光显微成像系统包括：多个激光器、合束装置、声光可调谐滤波器、扩束装置、偏振分光器、半波片、空间光调制器、聚光透镜、空间滤光器、涡旋半波片、第一二向色镜、第一4f系统、第二二向色镜、物镜、发射滤光片、镜筒透镜、第二4f系统、光阑、波段分光装置和相机；其中，每一个激光器发出一个波段的线偏振激光，多个激光器分别发出不同波段的线偏振激光；多束不同波段的线偏振激光经合束装置合束，同光轴传输至声光可调谐滤波器；通过声光可调谐滤波器快速选择通过的线偏振激光的波段；选定波段的线偏振激光经扩束装置进行扩束，经偏振分光器和半波片至空间光调制器；在空间光调制器上加载周期性的黑白相间的二值周期条纹，激光被反射后形成多级线偏振衍射光，空间光调制器的平面垂直于光轴；多级线偏振衍射光再经半波片和偏振分光器出射，先后两次经过偏振分光器和半波片，保证从偏振分光器出射的多级线偏振衍射光的偏振方向与入射的线偏振激光的偏振方向一致；多级线偏振衍射光经聚光透镜聚焦后至空间滤光器；聚光透镜的焦平面位于空间光调制器的傅里叶面，空间滤光器位于聚光透镜的焦平面处；多级线偏振衍射光经空间滤光器后只有±1级线偏振衍射光通过；再经过紧邻空间滤光器放置的涡旋半波片将±1级线偏振衍射光的偏振方向调节为与空间光调制器上的二值周期条纹的方向一致；±1级线偏振衍射光经第一二向色镜后通过第一4f系统，再经第二二向色镜，由物镜汇聚至位于物镜后焦面的样本上，第一4f系统将空间光调制器的傅里叶面延迟到物镜的后焦面，即通过第一4f系统使得物镜的后焦面位于空间光调制器的傅里叶面；±1级线偏振衍射光在物镜的后焦面上干涉形成正弦条纹照明，激发样本产生荧光，荧光返回后由物镜收集，经第二二向色镜后，通过发射滤光片滤波，再由镜筒透镜聚焦；第一二向色镜与第二二向色镜完全相同，但空间放置方向互相垂直，从而消除单独使用第二二向色镜引入的偏振畸变；在镜筒透镜与相机之间设置第二4f系统，从而将镜筒透镜的焦平面延迟到相机所在的平面；在第二4f系统中间首先放置光阑,用来控制成像视场的大小；在第二4f系统中间，光阑之后设置波段分光装置，波段分光装置将荧光按照波段从空间上分开，从而将不同波段荧光投射到相机不同的位置，荧光的每一个波段对应相机上的一个位置，作为一个光谱探测通道；相机通过不同位置采集相应波段的荧光，得到一张原始图像；保持二值周期条纹的角度不变，将空间光调制器上加载的二值周期条纹变成互补的二值周期条纹，再得到一张原始图像，从而得到二值周期条纹在一个角度下的两张原始图像，构成一组原始图像；二值周期条纹绕着水平的光轴旋转，每旋转π/n获得一组原始图像，n≥3，从而得到n组原始图像；对每一组原始图像按照不同的光谱探测通道进行层析图像重建得到n张层析图像，并将n张层析图像平均，得到每个光谱探测通道对应的宽场光学层析图像，进而得到光谱相关的信息；对这n张层析图像进行偏振解调，得到偏振相关的信息。/n...

【技术特征摘要】
1.一种基于偏振结构光调制的多维层析荧光显微成像系统，其特征在于，所述多维层析荧光显微成像系统包括：多个激光器、合束装置、声光可调谐滤波器、扩束装置、偏振分光器、半波片、空间光调制器、聚光透镜、空间滤光器、涡旋半波片、第一二向色镜、第一4f系统、第二二向色镜、物镜、发射滤光片、镜筒透镜、第二4f系统、光阑、波段分光装置和相机；其中，每一个激光器发出一个波段的线偏振激光，多个激光器分别发出不同波段的线偏振激光；多束不同波段的线偏振激光经合束装置合束，同光轴传输至声光可调谐滤波器；通过声光可调谐滤波器快速选择通过的线偏振激光的波段；选定波段的线偏振激光经扩束装置进行扩束，经偏振分光器和半波片至空间光调制器；在空间光调制器上加载周期性的黑白相间的二值周期条纹，激光被反射后形成多级线偏振衍射光，空间光调制器的平面垂直于光轴；多级线偏振衍射光再经半波片和偏振分光器出射，先后两次经过偏振分光器和半波片，保证从偏振分光器出射的多级线偏振衍射光的偏振方向与入射的线偏振激光的偏振方向一致；多级线偏振衍射光经聚光透镜聚焦后至空间滤光器；聚光透镜的焦平面位于空间光调制器的傅里叶面，空间滤光器位于聚光透镜的焦平面处；多级线偏振衍射光经空间滤光器后只有±1级线偏振衍射光通过；再经过紧邻空间滤光器放置的涡旋半波片将±1级线偏振衍射光的偏振方向调节为与空间光调制器上的二值周期条纹的方向一致；±1级线偏振衍射光经第一二向色镜后通过第一4f系统，再经第二二向色镜，由物镜汇聚至位于物镜后焦面的样本上，第一4f系统将空间光调制器的傅里叶面延迟到物镜的后焦面，即通过第一4f系统使得物镜的后焦面位于空间光调制器的傅里叶面；±1级线偏振衍射光在物镜的后焦面上干涉形成正弦条纹照明，激发样本产生荧光，荧光返回后由物镜收集，经第二二向色镜后，通过发射滤光片滤波，再由镜筒透镜聚焦；第一二向色镜与第二二向色镜完全相同，但空间放置方向互相垂直，从而消除单独使用第二二向色镜引入的偏振畸变；在镜筒透镜与相机之间设置第二4f系统，从而将镜筒透镜的焦平面延迟到相机所在的平面；在第二4f系统中间首先放置光阑,用来控制成像视场的大小；在第二4f系统中间，光阑之后设置波段分光装置，波段分光装置将荧光按照波段从空间上分开，从而将不同波段荧光投射到相机不同的位置，荧光的每一个波段对应相机上的一个位置，作为一个光谱探测通道；相机通过不同位置采集相应波段的荧光，得到一张原始图像；保持二值周期条纹的角度不变，将空间光调制器上加载的二值周期条纹变成互补的二值周期条纹，再得到一张原始图像，从而得到二值周期条纹在一个角度下的两张原始图像，构成一组原始图像；二值周期条纹绕着水平的光轴旋转，每旋转π/n获得一组原始图像，n≥3，从而得到n组原始图像；对每一组原始图像按照不同的光谱探测通道进行层析图像重建得到n张层析图像，并将n张层析图像平均，得到每个光谱探测通道对应的宽场光学层析图像，进而得到光谱相关的信息；对这n张层析图像进行偏振解调，得到偏振相关的信息。


2.如权利要求1所述的多维层析荧光显微成像系统，其特征在于，所述合束装置采用反射镜和二向色镜。


3.如权利要求1所述的多维层析荧光显微成像系统，其特征在于，所述第一4f系统和第二4f系统即为光学平面延迟缩放4f系统。


4.如权利要求1所述的多维层析荧光显微成像系统，其特征在于，所述扩束装置采用4f系统。


5.如权利要求1所述的多维层析荧光显微成像系统，其特征在于，所述空间滤光器与二值周期条纹的旋转角度相对应，包括n对通光孔，每一对通光孔位于一条通过圆形的直径上，相邻的每对通光孔之间的夹角为π/n。


6.如权利要求1所述的多维层析荧光显微成像系统，其特征在于，所述波段分光装置采用m-1个二向色镜，将荧光分成m个波段，每一个波段上设置一个或多个反射镜，从而调节相应波段的荧光的光路的空间位置，形成m个光谱探测通道。


7.一种如权利要求1所述的基于偏振结构光调制的多维层析荧光显微成像系统的显微成像方法，其特征在于，所述显微成像方法包括以下步骤：
1)每一个激光器发出一个波段的线偏振激光，多个激光器分别发出不同波段的线偏振激光；
2)多束不同波段的线偏振激光经合束装置合束，同光轴传输至声光可调谐滤波器；通过声光可调谐滤波器快速选择通过的线偏振激光的波段；
3)选定波段的线偏振激光经扩束装置进行扩束，经偏振分光器和半波片至空间光调制器；
4)在空间光调制器上加载周期性的黑白相间的二值周期条纹，激光被反射后形成多级线偏振衍射光，空间光调制器平面垂直于水平光轴；
5)多级线偏振衍射光再经半波片和偏振分光器出射，线偏振激光先后两次经过偏振分光器和半波片，保证从偏振分光器出射的多级线偏振衍射光的偏振方向与入射的线偏振激光的偏振方向一致；
6)多级线偏振衍射光经聚光透镜聚焦后至空间滤光器；聚光透镜的焦平面位于空间光调制器的傅里叶面，空间滤光器位于聚光透镜的焦平面处；多级线偏振衍射光经空间滤光器后只有±1级线偏振衍射光通过；
7)±1级线偏振衍射光经过紧邻空间滤光器放置的涡旋半波片，将±1级线偏振衍射光的偏振方向调节为与空间光调制器上的二值周期条纹的方向一致；
8)±1级线偏振衍射光经第一二向色镜后通过第一4f系统，再经第二二向色镜，由物镜汇聚至位于物镜后焦面的样本上，第一4f系统将空间光调制器的傅里叶面延迟到...

【专利技术属性】
技术研发人员：席鹏，张昊，李美琪，刘文辉，戴琼海，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：北京;11