一种微量细胞基因组测序文库构建方法技术

本发明专利技术涉及分子生物学实验技术领域，具体而言，涉及一种微量细胞基因组测序文库构建方法。该方法包括：a)获取待检测的DNA混合物；b)使用转座酶将所述DNA混合物片段化为核酸片段，并在所述核酸片段的两端加上相同转座接头；通过调整转座酶的工作浓度，将所述核酸片段的平均长度控制在5kb～20kb；c)利用扩增引物对所述核酸片段进行扩增。该方法在染色体结构变异和染色体外环状DNA的检测研究中表现突出，为基因组的组装和序列结构的精准定位提供新的前景。

【技术实现步骤摘要】
一种微量细胞基因组测序文库构建方法
本专利技术涉及分子生物学实验
，具体而言，涉及一种微量细胞基因组测序文库构建方法。
技术介绍
微量细胞测序，尤其是单细胞全基因组测序(Single-cellwhole-genomesequencing,scWGS)是现代分子生物学研究的一种前沿工具，能很好地揭示肿瘤等样品中的细胞异质性，发现各种突变，评估基因组不稳定性，尤其是在癌症发展过程中能够更加精确地挖掘出混合样本中的隐藏信息，具有很好的应用前景。目前已有的几种单细胞基因组技术包括DOP-PCR技术，多重置换扩增(MDA)技术，多重退火和基于环的扩增循环(MALBAC)技术，通过转座子插入进行线性扩增的LIANTI技术等。这些单细胞基因组测序方法可产生高度精确的短读长基因组测序数据，非常适用于发现拷贝数变异(CNV)，小片段插入或缺失，以及单核苷酸变异(SNV)，然而由于二代测序短读长的缺陷，基于单细胞基因组测序检测结构变异(SV)依然存在很大的挑战，目前也很少有相关报道。现有的单细胞基因组测序方法由于受到传统二代测序(NGS)技术测序短读长的限制，难以有效发现大片段或多重复序列的复杂染色体结构变异。染色体结构变异包括缺失、插入重复、倒位和易位，它们是体细胞遗传变异的主要来源，并且能够促进肿瘤的发生和转移。除SV以外，最近在人类细胞中发现了染色体外环状DNA(ecDNA)。目前研究发现ecDNA主要存在于肿瘤组织和肿瘤细胞系中，许多研究结果表明ecDNA在癌症中发挥调节作用，尤其是数百到数千kb的大分子ecDNA，可以在细胞中产生多个拷贝从而促进原癌基因表达，驱动肿瘤异质性发生以及可能参与了肿瘤的耐药性调控。这些基因组结构的异常变化对于我们揭开癌症的未知真相和复杂调控很重要，但目前尚无有效的方法实现单细胞分辨率对SV和ecDNA的检测。单分子实时(SMRT)测序技术在全基因组SV检测中具有独特的优势，采用连续滚环一致序列测序(CCS)模式生成DNA模板的高保真测序reads，能够实现高精度(99.8％)的长读长测序，从而提高了直接跨越SV连接点以及跨越包含重复序列复杂区域的阅读可能性。此外，长读长测序的高保真度比其他测序平台技术提高了SV检测的灵敏度和可靠性。但是，由于SMRTDNA测序需要大量的长DNA片段，单细胞来源的基因组DNA无法满足正常的建库要求，这给成功实现单细胞尺度的基因组检测带来了挑战。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术涉及一种微量细胞测序文库构建方法，包括：a)获取待检测的DNA混合物；b)使用转座酶将所述DNA混合物片段化为核酸片段，并在所述核酸片段的两端加上相同转座接头；通过调整转座酶的工作浓度，将所述核酸片段的平均长度控制在5kb～20kb；c)利用扩增引物对所述核酸片段进行扩增。根据本专利技术的再一方面，本专利技术涉及如上所述的方法在微量细胞基因组测序中应用。本专利技术还涉及用于微量细胞基因组测序文库构建的试剂盒，其特征在于，包含包装浓度为0.01ng/μL～0.05ng/μL的Tn5转座酶以及片段化缓冲液。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：1)本专利技术所提供的方法在染色体结构变异(SV)检测中表现突出，长读长的测序数据大大增加了直接捕获完整变体结构的可能，我们能在一条完整的测序数据中直接读取到结构变异后的结果。2)在微量细胞特别是单细胞层面上，长读长测序数据增强了对包含大量重复序列的复杂区域的解析能力，为基因组的组装和序列结构的精准定位提供新的前景。3)本专利技术所提供的方法提供了一种在单细胞水平上研究染色体外环状DNA(ecDNA)的方法。附图说明为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本专利技术Smile-seq方法技术流程示意图；图2为本专利技术一个实施例中单细胞gDNA扩增产物长度分布图，可见大部分扩增产物长度在6kb左右；图3为本专利技术一个实施例中通过PB测序后分析得到的CCSreads的读长分布，与建库前的扩增产物一致；图4为本专利技术一个实施例中使用Smile-seq检测SV结果示例；a图展示了本次实验中检测到的所有缺失，插入，重复，倒置等SV突变类型的结果统计；b图展示了用Smile-seq检测到的其中两个在k562细胞系中常见的易位突变：9号与22号染色体易位产生BCR-ABL1融合基因及NUP214-XKR3融合基因示例；图5为本专利技术一个实施例中用Smile-seq技术检测和鉴定K562中的ecDNA结果示例，a图为筛选K562细胞中ecDNA的流程示意图；b图所示实验中检测到的候选ecDNA及其长度分布统计；图c和d通过PCR和Sanger测序对部分ecDNA验证结果示例。具体实施方式现将详细地提供本专利技术实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本专利技术。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本专利技术进行多种修改和变化而不背离本专利技术的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。因此，旨在本专利技术覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本专利技术的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本专利技术更广阔的方面。本专利技术涉及一种微量细胞测序文库构建方法，包括：a)获取待检测的DNA混合物；b)使用转座酶将所述DNA混合物片段化为核酸片段，并在所述核酸片段的两端加上相同转座接头；通过调整转座酶的工作浓度，将所述核酸片段的平均长度控制在5kb～20kb；c)利用扩增引物对所述核酸片段进行扩增。为了实现在微量细胞中得到长DNA片段文库，我们开发了一种新的微量细胞测序方法并取名Smile-seq，该方法通过转座子插入扩增单细胞基因组DNA进行长片段扩增。与常用的设计不同，我们将两分子相同序列的接头嵌入到转座酶上，理论上可以通过转座PCR实现原始DNA片段的100％回收(传统转座酶采用不同的两种接头只有50％效率)。此外，通过调整转座酶的工作浓度控制核酸片段的长度，本专利技术也克服了相同序列的接头容易发生环化的问题。这些扩增的长片段DNA用于在SMRTDNA测序平台等第三代测序(TGS)平台上直接测序得到高质量单细胞基因组序列信息。对SV和/或ecDNA的检测具有独特的优势。本专利技术中的DNA混合物可以来源于任何样品，其中术语“样品”以其最广泛的含义使用。在一种含义中，其意指包括细胞(例如，人、细菌、酵母和真菌)、组织或活体、或获自任何来源的样本或培养物本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.微量细胞测序文库构建方法，其特征在于，包括：/na)获取待检测的DNA混合物；/nb)使用转座酶将所述DNA混合物片段化为核酸片段，并在所述核酸片段的两端加上相同转座接头；/n通过调整转座酶的工作浓度，将所述核酸片段的平均长度控制在5kb～20kb；/nc)利用扩增引物对所述核酸片段进行扩增。/n

【技术特征摘要】
1.微量细胞测序文库构建方法，其特征在于，包括：
a)获取待检测的DNA混合物；
b)使用转座酶将所述DNA混合物片段化为核酸片段，并在所述核酸片段的两端加上相同转座接头；
通过调整转座酶的工作浓度，将所述核酸片段的平均长度控制在5kb～20kb；
c)利用扩增引物对所述核酸片段进行扩增。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述转座酶选自Tn1、Tn2、Tn3、Tn4、Tn5、Tn6、Tn7、Tn9、Tn10、Tn551、Tn971、Tn916、Tn1545、Tn1681、Tgf2、Tol2、Himar1以及HARBI1中的一种或任意多种的组合。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述转座酶为Tn5，工作浓度为0.01ng/μL～0.05ng/μL。


4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤b)中，所用片段化缓冲液的主要成分包括40mM～60mMTAPS-NaOH或TAPS-KOH，20mM～30mMMg2+，35g/100ml～45g/100ml的PEG8000，pH＝8.0～8.6。


5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述扩增引物包括测序接头，细胞识别条码以及用于与所述转座接头结合并进行PCR延伸扩增的锚定序列。


6....

【专利技术属性】
技术研发人员：范小英，苏丹，
申请(专利权)人：广州再生医学与健康广东省实验室，
类型：发明
国别省市：广东;44