四环素ELISA检测试剂盒制造技术

本实用新型专利技术涉及一种检测动物源性食品中四环素残留的ＥＬＩＳＡ检测试剂盒。该试剂盒组成包括：９６孔酶标板、酶标二抗、四环素抗体工作液、四环素６个浓度标准品溶液、底物显色液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液、高浓度标准品溶液、盖板膜、自封袋、说明书和质检报告。采用间接竞争ＥＬＩＳＡ方法，在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，样本中残留的四环素将和微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗四环素抗体，加入酶标二抗后，用ＴＭＢ底物显色，样本吸光度值与其所含四环素的含量成负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中四环素的残留量。与仪器分析技术相比具有操作简便、费用低廉、灵敏度高等特点。（*该技术在2017年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本技术涉及动物源性食品中药物残留量的检测试剂 盒，特别是检测动物源性食品中四环素残留量的试剂盒。(二)
技术介绍
在欧盟第675/92号令中(出台于1992年3月18日)已 经初步规定在肌肉及牛奶中的四环素族化合物的总量不得超过100pg/L，在肾 脏，肝脏及鸡蛋中分别不得超过600iag/L, 300吗/L及200昭/L。目前，四环素族抗菌素残留的检测是用高效液相色谱来进行的，HPLC方法 的缺点是制备样品要耗费大量时间，并且需要昂贵的实验室设备。(三)
技术实现思路
本技术所要解决的问题是提供一种小巧轻便的 四环素残留检测试剂盒，其操作简便，检测快速、准确、灵敏度高，成本低， 稳定性好，需要的技术含量不高，可进行一次连续多个样品中四环素含量的测 定，减少了检验样本所需要的时间。本技术的技术方案是采用96孔聚苯乙烯试剂板作为固相载体，放入 真空铝铂袋内，在试剂盒酶标板微孔条上预包被四环素偶联抗原制成检测板， 以塑料硬膜为盖板膜，将40ml浓缩洗涤液、50ml浓缩复溶液、12ml酶标二抗、 7ml四环素抗体工作液、7ml显色液A液、7ml显色液B液、7ml终止液和6瓶 lml梯度浓度的标准品溶液和1瓶lml高浓度标准品溶液，试剂用不同大小、不 同颜色的塑料瓶和玻璃瓶盛装并固定在泡沫塑料模具中与试剂板、盖板膜一同 封装在盒内，以便于携带和运输。每一个试剂盒中的试剂足够进行96次测定(包 括标准分析孔)，既可进行一次连续多个样品的检测，也可以将板孔拆开多次检 测。检测时，样本中的残留物(四环素)将和酶标板微孔条上预包被的偶联四 环素抗原竟争抗四环素抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光值 与样本中所含残留物(四环素)的含量成负相关，与标准曲线比较再乘以其对 应的稀释倍数，即可得出样品中四环素的残留量，其操作简便易行。经实验表明本试剂盒具有很高的灵敏度组织样品的最低检测限为5pg/kg、 蜂蜜的最低检测限为4pg/kg;组织样品的回收率为80%±15%、蜂蜜的回收率为80%±15%;同咪诺四环素的交叉反应率为125%、同吡咯烷甲四环素的交叉 反应率为110%、同金霉素的交叉反应率为70%、同土霉素的交叉反应率为20%。 相对于其他四环素残留检测方法，本试剂盒所需仪器较少，只需要酶标仪、匀 质器、振荡机和微量加样器，同类实验室一般均有配备，所需成本较低。本实验新型的有益效果是能快速、简便、灵敏、准确地用于动物源性食 品中四环素残留的检测。 附图说明图1为本实验新型酶联板的侧面横剖面图(长为12.8cm);图2为本实验新型酶联板的俯视图3为本实验新型酶联板的侧面纵剖面图(长为8.55cm);图4为本实验新型盖板膜平面图5为本实验新型试剂瓶纵剖面平面图6为本实验新型固定泡沬模具的俯视图。参见附图酶标反应微孔条(2)预包被四环素偶联抗原(3)固定于酶标 板的外框支撑架(1)上，酶标反应微孔条(2)可随要求拆卸；盖板膜(4)用 于酶标板置水浴或恒温箱内反应时封盖酶标反应微孔条(2);透明帽的半透明 塑料试剂瓶(5)用于封装40ml浓缩洗涤液；蓝色帽的半透明塑料试剂瓶(5) 用于封装50ml浓缩复溶液；白色帽(6)的白色塑料试剂瓶(7)用于封装7ml 显色液A液，红色帽(6)的黑色塑料试剂瓶(7)用于封装7ml显色液B液， 黄色帽(6)的白色塑料试剂瓶(7)用于封装7ml终止液，绿色帽的白色塑料 试剂瓶(8)用于封装7ml四环素抗体工作液，红色帽的白色塑料试剂瓶(8) 用于封装12ml酶标二抗，白色帽的棕色玻璃试剂瓶(9)用于封装lml/瓶的标 准品溶液及lml高浓度标准品溶液；泡沬塑料模具(10)有15个瓶位，放置位 置依次为40ml浓缩洗涤液瓶位(18), 50ml浓缩复溶液(11 )， 7ml显色液A 液瓶位(14 ), 7ml显色液B液瓶位(13 ), 7ml终止液瓶位(12 )、 7ml四环素 抗体工作液瓶位(16), 12ml酶标二抗瓶位(15)， 6种lml/瓶各种浓度的标准 品溶液及1瓶lml高浓度标准品溶液瓶位(17 )。本实验新型的实施例一、样本的前处理1. 配液配液1:复溶工作液用去离子水将2x浓缩复溶液按1: 1体积比进行稀释(1份2x 浓缩复溶液+l份去离子水)用于样本的复溶 配液2: 0.02M磷酸盐缓冲液称取2.58g十二水合磷酸氢二钠和0.435g 二水合磷酸二氢钠 加去离子水溶解定容至500ml 酉己液3: Mcllvain-buffer称取Citric acid monohydrate 12.9g、 二水合磷酸二氢钠10.9g、 乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA-Sodiumsalt) 37.2g加去离子水溶解 定容至1L，用磷酸调pH至3.8 配液4:洗脱液含20mM Oxalic acid甲醇溶液(=1.8g/l) 称取1.8g Oxalic acid加甲醇溶解定容至1L 配液9:洗涤工作液用去离子水将20x浓缩洗涤液按1: 19体积比进行稀释(或 按需量稀释)(1份20x浓缩洗涤液+19份去离子水)用于酶标板2. 蜂蜜样本前处理-.称取l士0.05g蜂蜜至带锣口盖的瓶中(80ml),用0.02M磷酸盐缓冲液用去 离子水按l: 49体积比进行稀释(1份磷酸盐缓冲液+49份去离子水)；用超声 波均质5分钟；强烈混合用涡旋仪涡动2min;加样之前混均(颠倒振荡)；取 50|il分析。3. 蜂蜜样本前处理准确称取4土0.05g蜂蜜样本至50ml聚苯乙烯离心管中，加入0.5ml 1M NaOH用振荡器振荡混匀后静置20min;加入0.5mllMHCl，用振荡器振荡混勾 (pH应在3左右，若没在此范围请用盐酸或氢氧化钠调至准确)，再加入7ml酸化乙腈(pH4.0左右)，用振荡器充分振荡10min,3000g以上，室温离心10min; 取上清液3ml至10ml干净的玻璃试管中，于50-6(TC水浴氮气流下吹干；加 lml复溶工作液溶解干燥残留物；取50)il用于分析。 4.肉组织样品前处理用均质器均质组织样本；称取5士0.05g均质物至50ml聚苯乙烯离心管中， 加入25ml Mcllvain-buffer用振荡器振荡30min， 3000g以上，l(TC离心10min, 收集上清液至50ml聚苯乙烯离心管中；沉淀物重复提取一次，将两次的提取液 合二为一，用折叠滤纸过滤，收集滤液；取5ml滤液用RIDAC18柱按以下步骤 纯化；用4ml甲醇(100%)洗涤柱子，用3ml去离子水洗涤柱子；取5ml滤液 进柱，用3ml去离子水洗涤柱子；小心的压出所有的液体，用2ml洗脱液洗脱 样品，流速为15滴/分钟；洗脱的样品液用复溶工作液按1: 9体积比进行稀释 (5(^l样品液加入450^il复溶工作液混匀)；取50pl进行分析。 二、使用试剂盒的操作步骤1、 从4。C冷藏环境中取出所需试剂，置室温(20-25°C )平衡30min以上，注 意每种液体试剂使用前均须摇匀。2、 取出框架及需要数量的微孔，将不用的微孔放入自封袋，保存于2-8。C。3、 洗涤工作液在使用前也需回温。4、 编号将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平 行，并记录标准孔和样本孔本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测动物源性食品中四环素的ＥＬＩＳＡ检测试剂盒，包括盒体和盒内的一块９６孔的酶标板、一张盖板膜、１４瓶试剂和放试剂的下凹瓶位、一个自封袋、一份说明书和一份质检报告，其特征在于：酶标板是采用９６孔试剂板作为固相载体，在试剂盒微孔条上预包被四环素偶联抗原制成的检测板，１４瓶试剂分别为６瓶标准品溶液、１瓶高浓度标准品溶液、酶标二抗、四环素抗体工作液、显色液Ａ液、显色液Ｂ液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液，下凹瓶位共１５个。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：沈建忠，何方洋，万宇平，冯才伟，吴小平，冯月君，屈晓丽，陈炜玲，汪善良，刘平，孙倩，
申请(专利权)人：北京望尔生物技术有限公司，北京望尔康泰生物技术有限公司，
类型：实用新型
国别省市：11[中国|北京]