核酸的靶向整合制造技术

当前公开的主题涉及适合于表达重组蛋白的靶向整合(TI)宿主细胞，以及产生和使用所述TI宿主细胞的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】核酸的靶向整合相关申请的交叉引用本申请要求2017年12月22日提交的美国临时申请号62/609,806和2018年7月27日提交的美国临时申请号62/711,272的权益，将这些申请中的每一篇的公开内容通过引用以其整体并入本文。
当前公开的主题涉及适合于表达重组蛋白的靶向整合(TI)宿主细胞，以及产生和使用所述TI宿主细胞的方法。序列表本说明书参照序列表(2018年12月21日电子提交的名称为“00B2060779SEQ.txt”的.txt文件)。00B2060779SEQ.txt文件于2018年12月20日生成，并且大小为1,251,240字节。将序列表的全部内容通过引用特此并入。
技术介绍
由于细胞生物学和免疫学的迅速发展，因此对开发用于多种疾病(包括癌症、心血管疾病和代谢性疾病)的新型治疗性重组蛋白的需求日益增长。这些生物药物候选物通常由能够表达目的蛋白质的商业细胞系来制造。例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞已广泛适应于产生单克隆抗体。开发商业细胞系的常规策略包括随机整合编码目的多肽的核苷酸序列，接着选择和分离产生目的多肽的细胞系。然而，该方法有若干个缺点。首先，这种整合不仅是罕见的事件，而且鉴于核苷酸序列整合位置的随机性，这些罕见的事件可能导致各种各样的基因表达和细胞生长表型。这种变异被称为“位置效应变异”，至少部分起源于真核细胞基因组中存在的复杂基因调节网络以及某些基因组基因座对于整合和基因表达的可及性。第二，随机整合策略通常不能提供对整合至宿主细胞基因组中的基因拷贝数的控制。实际上，基因扩增方法通常用于获得高产细胞。然而，这种基因扩增可能导致不需要的细胞表型，如不稳定的细胞生长和/或产物表达。第三，由于随机整合过程中固有的整合基因座异质性，在转染后筛选成千上万个克隆以分离显示出目的多肽的期望表达水平的细胞系是费时且费力的。即使在分离此类细胞系之后，也不能保证目的多肽的稳定表达，并且可能需要进一步筛选以获得稳定的商业细胞系。最后，由随机整合的细胞系产生的多肽展现出高度的序列差异，这可能部分是由于用于选择目的多肽的高水平表达的选择剂的诱变性所致。
技术实现思路
当前公开的主题涉及适合于重组蛋白的表达的靶向整合(TI)宿主细胞。当前公开的主题不仅提供了具有高生产力的宿主细胞TI位点，而且还提供了通过重组酶介导的盒式交换(RMCE)将多个目的序列引入宿主细胞中单一TI基因座的新型方法。所述RMCE方法的优点包括增加的生产力和由相同TI基因座以不同比率共表达多种多肽的灵活性。例如但非限制性地，本文公开的RMCE策略允许向TI基因座插入一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或更多个序列(例如，抗体重链(HC)或轻链(LC)序列)。通过同时靶向八个或更多个序列的能力，所述两质粒RMCE能够调节mAb的HC和LC链比率以改善生产力，表达具有多条链的复杂分子，以及用抗体靶向转基因、内源基因或RNAi以修改细胞途径。在某些实施方案中，TI宿主细胞包含在宿主细胞基因组的基因座内的整合位点处整合的外源核苷酸序列，其中所述基因座与选自SEQIDNo.1-7的序列为至少约90％同源。在某些实施方案中，紧接在所述整合的外源核苷酸序列的5'的核苷酸序列选自与NW_006874047.1的核苷酸41190-45269、NW_006884592.1的核苷酸63590-207911、NW_006881296.1的核苷酸253831-491909、NW_003616412.1的核苷酸69303-79768、NW_003615063.1的核苷酸293481-315265、NW_006882936.1的核苷酸2650443-2662054、以及NW_003615411.1的核苷酸82214-97705至少约90％同源的序列。在某些实施方案中，紧接在所述整合的外源核苷酸序列的3'的核苷酸序列选自与NW_006874047.1的核苷酸45270-45490、NW_006884592.1的核苷酸207912-792374、NW_006881296.1的核苷酸491910-667813、NW_003616412.1的核苷酸79769-100059、NW_003615063.1的核苷酸315266-362442、NW_006882936.1的核苷酸2662055-2701768、或NW_003615411.1的核苷酸97706-105117至少约90％同源的序列。在某些实施方案中，所述整合的外源核苷酸序列与选自以下的核苷酸序列可操作地连接：与选自SEQIDNo.1-7的序列至少约90％同源的序列。在某些实施方案中，TI宿主细胞包含在选自以下的内源基因内的整合位点处整合的外源核苷酸序列：LOC107977062(SEQIDNO.1)、LOC100768845(SEQIDNO.2)、ITPR2(SEQIDNO.3)、ERE67000.1(SEQIDNO.4)、UBAP2(SEQIDNO.5)、MTMR2(SEQIDNO.6)、XP_003512331.2(SEQIDNO.7)、以及与其至少约90％同源的序列。在某些实施方案中，将所述外源核苷酸序列整合在与选自以下的内源基因可操作地连接的整合位点处：LOC107977062(SEQIDNO.1)、LOC100768845(SEQIDNO.2)、ITPR2(SEQIDNO.3)、ERE67000.1(SEQIDNO.4)、UBAP2(SEQIDNO.5)、MTMR2(SEQIDNO.6)、XP_003512331.2(SEQIDNO.7)、以及与其至少约90％同源的序列。在某些实施方案中，所述整合的外源核苷酸序列由选自以下的核苷酸序列侧接：与选自SEQIDNo.1-7的序列至少约90％同源的序列。在某些实施方案中，将所述外源核苷酸序列整合在与选自以下的序列的全部或部分紧邻的整合位点处：与选自SEQIDNo.1-7的序列至少约90％同源的序列。在某些实施方案中，TI宿主细胞是哺乳动物宿主细胞。在某些实施方案中，TI宿主细胞是仓鼠宿主细胞、人宿主细胞、大鼠宿主细胞或小鼠宿主细胞。在某些实施方案中，TI宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)宿主细胞、CHOK1宿主细胞、CHOK1SV宿主细胞、DG44宿主细胞、DUKXB-11宿主细胞、CHOK1S宿主细胞或CHOK1M宿主细胞。在某些实施方案中，TI宿主细胞包含整合的外源核苷酸序列，其中所述外源核苷酸序列包含一个或多个重组识别序列(RRS)。在某些实施方案中，所述外源核苷酸序列包含至少两个RRS。所述RRS可以被重组酶(例如Cre重组酶、FLP重组酶、Bxb1整合酶或整合酶)识别。所述RRS可以选自LoxP序列、LoxPL3序列、LoxP2L序列、LoxFas序列、Lox511序列、Lox2272序列、Lox2372序列、Lox5171序列、Loxm2序列、Lox71序列、Lox66序列、FRT序列、Bxb1attP序列、Bxb1attB序列、attP序列、以及attB序列。在某些实施方案中，所述外源核本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种靶向整合(TI)宿主细胞，所述靶向整合(TI)宿主细胞包含在所述宿主细胞的基因组的特定基因座内的整合位点处整合的外源核苷酸序列，其中所述基因座与选自SEQ IDNo.1-7的序列为至少约90％同源。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171222 US 62/609,806;20180727 US 62/711,2721.一种靶向整合(TI)宿主细胞，所述靶向整合(TI)宿主细胞包含在所述宿主细胞的基因组的特定基因座内的整合位点处整合的外源核苷酸序列，其中所述基因座与选自SEQIDNo.1-7的序列为至少约90％同源。


2.根据权利要求1所述的TI宿主细胞，其中紧接在所述整合的外源的核苷酸序列的5'的核苷酸序列选自与NW_006874047.1的核苷酸41190-45269、NW_006884592.1的核苷酸63590-207911、NW_006881296.1的核苷酸253831-491909、NW_003616412.1的核苷酸69303-79768、NW_003615063.1的核苷酸293481-315265、NW_006882936.1的核苷酸2650443-2662054、或NW_003615411.1的核苷酸82214-97705至少约90％同源的序列。


3.根据权利要求1所述的TI宿主细胞，其中紧接在所述整合的外源核苷酸序列的5'的核苷酸序列选自来自NW_006874047.1的核苷酸45269、NW_006884592.1的核苷酸207911、NW_006881296.1的核苷酸491909、NW_003616412.1的核苷酸79768、NW_003615063.1的核苷酸315265、NW_006882936.1的核苷酸2662054、或NW_003615411.1的核苷酸97705的至少15个碱基对、至少20个碱基对、至少30个碱基对、至少40个碱基对、至少50个碱基对、至少75个碱基对、至少100个碱基对、至少150个碱基对、至少200个碱基对、至少300个碱基对、至少400个碱基对、至少500个碱基对、至少1,000个碱基对、至少1,500个碱基对、至少2,000个碱基对、至少3,000个碱基对的序列。


4.根据权利要求1所述的TI宿主细胞，其中紧接在所述整合的外源核苷酸序列的3'的核苷酸序列选自与NW_006874047.1的核苷酸45270-45490、NW_006884592.1的核苷酸207912-792374、NW_006881296.1的核苷酸491910-667813、NW_003616412.1的核苷酸79769-100059、NW_003615063.1的核苷酸315266-362442、NW_006882936.1的核苷酸2662055-2701768、或NW_003615411.1的核苷酸97706-105117至少约90％同源的序列。


5.根据权利要求1所述的TI宿主细胞，其中紧接在所述整合的外源核苷酸序列的3'的核苷酸序列选自来自NW_006874047.1的核苷酸45270、NW_006884592.1的核苷酸207912、NW_006881296.1的核苷酸491910、NW_003616412.1的核苷酸79769、NW_003615063.1的核苷酸315266、NW_006882936.1的核苷酸2662055、或NW_003615411.1的核苷酸97706的至少15个碱基对、至少20个碱基对、至少30个碱基对、至少40个碱基对、至少50个碱基对、至少75个碱基对、至少100个碱基对、至少150个碱基对、至少200个碱基对、至少300个碱基对、至少400个碱基对、至少500个碱基对、至少1,000个碱基对、至少1,500个碱基对、至少2,000个碱基对、至少3,000个碱基对的序列。


6.根据权利要求1-5中任一项所述的TI宿主细胞，其中所述整合的外源核苷酸序列与选自以下的核苷酸序列可操作地连接：与选自SEQIDNo.1-7的序列至少约90％同源的序列。


7.一种靶向整合(TI)宿主细胞，所述靶向整合(TI)宿主细胞包含在选自以下的内源基因内的整合位点处整合的外源核苷酸序列：LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2、XP_003512331.2、以及与其至少约90％同源的序列。


8.一种TI宿主细胞，所述TI宿主细胞包含在与选自以下的内源基因可操作地连接的整合位点处整合的外源核苷酸序列：LOC107977062、LOC100768845、ITPR2、ERE67000.1、UBAP2、MTMR2、XP_003512331.2、以及与其至少约90％同源的序列。


9.一种TI宿主细胞，所述TI宿主细胞包含在与选自以下的序列的全部或部分紧邻的整合位点处整合的外源核苷酸序列：与选自SEQIDNo.1-7的序列至少约90％同源的序列。


10.根据权利要求1-9中任一项所述的TI宿主细胞，其中所述TI宿主细胞是哺乳动物宿主细胞。


11.根据权利要求10所述的TI宿主细胞，其中所述TI宿主细胞是仓鼠宿主细胞、人宿主细胞、大鼠宿主细胞或小鼠宿主细胞。


12.根据权利要求10或11所述的TI宿主细胞，其中所述TI宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)宿主细胞、CHOK1宿主细胞、CHOK1SV宿主细胞、DG44宿主细胞、DUKXB-11宿主细胞、CHOK1S宿主细胞或CHOK1M宿主细胞。


13.根据权利要求1-12中任一项所述的TI宿主细胞，其中所述外源核苷酸序列包含一个或多个重组识别序列(RRS)，其中所述RRS可以由重组酶识别。


14.根据权利要求13所述的TI宿主细胞，其中所述外源核苷酸序列包含至少两个RRS。


15.根据权利要求13或14所述的TI宿主细胞，其中所述重组酶是Cre重组酶或FLP重组酶。


16.根据权利要求13或14所述的TI宿主细胞，其中所述重组酶是Bxb1整合酶或整合酶。


17.根据权利要求13-16中任一项所述的TI宿主细胞，其中所述RRS选自LoxP序列、LoxPL3序列、LoxP2L序列、LoxFas序列、Lox511序列、Lox2272序列、Lox2372序列、Lox5171序列、Loxm2序列、Lox71序列、Lox66序列、FRT序列、Bxb1attP序列、Bxb1attB序列、attP序列、以及attB序列。


18.根据权利要求14-17中任一项所述的TI宿主细胞，其中所述外源核苷酸序列包含第一RRS和第二RRS、以及位于所述第一RRS与所述第二RRS之间的至少一个选择标记。


19.根据权利要求18所述的TI宿主细胞，其包含第一选择标记，其中所述第一选择标记选自氨基糖苷磷酸转移酶(APH)、潮霉素磷酸转移酶(HYG)、新霉素、G418APH、二氢叶酸还原酶(DHFR)、胸苷激酶(TK)、谷氨酰胺合成酶(GS)、天冬酰胺合成酶、色氨酸合成酶(吲哚)、组氨醇脱氢酶(组氨醇D)、杀稻瘟素、博来霉素、腐草霉素、氯霉素、Zeocin、和霉酚酸。


20.根据权利要求18或19所述的TI宿主细胞，其进一步包含第二选择标记，其中所述第一选择标记和所述第二选择标记是不同的。


21.根据权利要求20所述的TI宿主细胞，其中所述第二选择标记选自氨基糖苷磷酸转移酶(APH)、潮霉素磷酸转移酶(HYG)、新霉素、G418APH、二氢叶酸还原酶(DHFR)、胸苷激酶(TK)、谷氨酰胺合成酶(GS)、天冬酰胺合成酶、色氨酸合成酶(吲哚)、组氨醇脱氢酶(组氨醇D)、杀稻瘟素、博来霉素、腐草霉素、氯霉素、Zeocin、和霉酚酸。


22.根据权利要求20或21所述的TI宿主细胞，其进一步包含第三选择标记和内部核糖体进入位点(IRES)，其中所述IRES与所述第三选择标记可操作地连接。


23.根据权利要求22所述的TI宿主细胞，其中所述第三选择标记不同于所述第一选择标记或所述第二选择标记。


24.根据权利要求22或23所述的TI宿主细胞，其中所述第三选择标记选自绿色荧光蛋白(GFP)标记、增强的GFP(eGFP)标记、合成GFP标记、黄色荧光蛋白(YFP)标记、增强的YFP(eYFP)标记、青色荧光蛋白(CFP)标记、mPlum标记、mCherry标记、tdTomato标记、mStrawberry标记、J-红色标记、DsRed-单体标记、mOrange标记、mKO标记、mCitrine标记、Venus标记、YPet标记、翠绿色6标记、CyPet标记、mCFPm标记、蔚蓝色标记、和T-天蓝色标记。


25.根据权利要求18-24中任一项所述的TI宿主细胞，其进一步包含第三RRS，其中所述第三RRS位于所述第一RRS与所述第二RRS之间，并且所述第三RRS相对于所述第一RRS或所述第二RRS是异种特异性的。


26.根据权利要求13-25中任一项所述的TI宿主细胞，其中所述外源核苷酸序列包含至少一个选择标记和至少一个外源目的序列(SOI)。


27.根据权利要求13-26中任一项所述的TI宿主细胞，其中所述外源核苷酸序列进一步包含至少一个外源SOI。


28.根据权利要求27所述的TI宿主细胞，其中所述外源SOI位于所述第一RRS与所述第二RRS之间。


29.根据权利要求27或28所述的TI宿主细胞，其中所述SOI编码单链抗体、抗体轻链、抗体重链、单链Fv片段(scFv)、或Fc融合蛋白。


30.根据权利要求25-29中任一项所述的TI宿主细胞，其中所述外源核苷酸序列进一步包含位于所述第一RRS与所述第三RRS之间的至少一个外源SOI、以及位于所述第三RRS与所述第二RRS之间的至少一个外源SOI。


31.根据权利要求30所述的TI宿主细胞，其中所述SOI编码单链抗体、抗体轻链、抗体重链、单链Fv片段(scFv)、或Fc融合蛋白。


32.一种制备表达目的多肽的TI宿主细胞的方法，所述方法包括：
a)提供TI宿主细胞，所述TI宿主细胞包含在所述TI宿主细胞的基因组的基因座内的位点处整合的外源核苷酸序列，其中所述基因座与选自SEQIDNo.1-7的序列为至少约90％同源，其中所述外源核苷酸序列包含侧接至少一个第一选择标记的两个RRS；
b)将载体引入a)中提供的所述细胞中，所述载体包含与所述整合的外源核苷酸序列上的两个RRS匹配并且侧接至少一个外源SOI和至少一个第二选择标记的两个RRS；
c)引入重组酶或编码重组酶的核酸，其中所述重组酶识别所述RRS；以及
d)选择表达所述第二选择标记的TI细胞，从而分离表达所述多肽的TI宿主细胞。


33.根据权利要求32所述的方法，其中所述重组酶是Cre重组酶或FLP重组酶。


34.根据权利要求32所述的方法，其中所述重组酶是Bxb1整合酶或整合酶。


35.根据权利要求32-34中任一项所述的方法，其中所述SOI编码单链抗体、抗体轻链、抗体重链、单链Fv片段(scFv)、或Fc融合蛋白。


36.根据权利要求32-35中任一项所述的方法，其中所述TI宿主细胞是哺乳动物宿主细胞。


37.根据权利要求36所述的方法，其中所述TI宿主细胞是仓鼠宿主细胞、人宿主细胞、大鼠宿主细胞或小鼠宿主细胞。


38.根据权利要求36或37所述的方法，其中所述TI宿主细胞是CHO宿主细胞、CHOK1宿主细胞、CHOK1SV宿主细胞、DG44宿主细胞、DUKXB-11宿主细胞、CHOK1S宿主细胞或CHOK1M宿主细胞。


39.一种表达目的多肽的方法，所述方法包括：
a)提供TI宿主细胞，所述TI宿主细胞包含至少一个外源SOI和至少一个选择标记，其中所述至少一个外源SOI和至少一个选择标记由在所述TI宿主细胞的基因组的基因座内整合的两个RRS侧接，其中所述基因座与选自SEQIDNo.1-7的序列为至少约90％同源；以及
b)在适合于表达所述目的多肽的条件下培养a)中的所述细胞并从中回收目的多肽。


40.一种制备表达至少第一目的多肽和第二目的多肽的TI宿主细胞的方法，所述方法包括：
a)提供TI宿主细胞，所述TI宿主细胞包含在所述宿主细胞的基因组的基因座内的位点处整合的外源核苷酸序列，其中所述基因座与选自SEQIDNo.1-7的序列为至少约90％同源，其中所述外源核苷酸序列包含侧接至少一个第一选择标记的第一RRS和第二RRS、以及位于所述第一RRS与所述第二RRS之间的第三RRS，并且全部所述RRS是异种特异性的；
b)将第一载体引入a)中提供的所述细胞中，所述第一载体包含与所述整合的外源核苷酸序列上的所述第一RRS和所述第三RRS匹配并且侧接至少一个第一外源SOI和至少一个第二选择标记的两个RRS；
c)将第二载体引入a)中提供的所述细胞中，所述第二载体包含与所述整合的外源核苷酸序列上的所述第二RRS和所述第三RRS匹配并且侧接至少一个第二外源SOI的两个RRS；
d)引入一种或多种重组酶或编码一种或多种重组酶的一种或多种核酸，其中所述一种或多种重组酶识别所述RRS；以及
e)选择表达所述第二选择标记的TI细胞，从而分离...

【专利技术属性】
技术研发人员：C·K·D·吴，Y·G·克劳福德，A·沈，M·周，B·R·斯内德科，S·米沙吉，A·E·高，
申请(专利权)人：豪夫迈·罗氏有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH