测定细胞形态学参数变化的方法技术

本发明专利技术公开了一种测定细胞形态学参数变化的方法，例如，细胞的位置和／或形状。该方法包括采用一种当受到合适的第一波长光照射时由不可检测状态变成可检测状态的标记物质来标记细胞群。当用合适的第一波长光以预定模式对标记细胞的亚群进行照射时，则可确定细胞亚群，其中由细胞亚群所覆盖的区域符合采用的照射模式。接着，采用选定的适合于检测标记物的第二波长的照射光来检测至少部分细胞群，可显示指示所述细胞形态学参数变化的标记物质的分布模式。本申请还描述和请求保护了一种筛选测试试剂的方法，所述试剂对细胞形态学参数的影响尚待测定。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种测定细胞形态学参数变化的新方法，例如细胞的位置和/或形状，该方法提高了通量并适于自动操作。细胞运动性是各种正常和异常细胞过程的必要因素。许多细胞类型形态上显示了显著的变化，例如神经轴索的运动、延长以及细胞分裂过程中的形状变化。伤口愈合、胚胎发生及免疫系统反应例如趋化性，都需要特定的细胞类型来识别并通过细胞运动对外部刺激作出响应。研究控制细胞运动的机制和开发一些能够调节细胞运动的试剂，对于开发新的治疗法是非常有意义的。测定神经突的长出和候选药物对该过程的影响是评估对包括中风和脊髓损伤的各种伤害，对神经变性状况如帕金森氏病和阿尔茨海默氏病的可能治疗的关键。已经有多种关于测定细胞运动方法的描述，它们大体可分为两类。第一类涉及将细胞固定于膜屏障的一侧，并测定细胞穿过屏障的运动的方法(Hagedom等人，Biochim.Biophys.Acta，(1995)，1269(3)，221-232；Bock和Mrowietz，J.Biochim.Biophys.Methods，(2001)，48(3)，257-268；Dunzendorfer等人，Immunol.Lett.，(2000)，71(1)，5-11)。第二类利用光学方法测定细胞运动，该方法通常涉及获得一系列细胞的慢过程图像，并接着对图像进行分析来测定细胞运动(Thurston等人，Cytometry，(1988)，9，411-417；Thurston等人，Experimental Cell Research，(1986)，165，380-390)。对中枢神经系统研究的主要尝试集中于鉴别影响神经突生长的化合物上。促进神经生长的制剂对多种疾病及创伤具有治疗潜力，包括中风、脊髓损伤，以及神经变性状况如帕金森氏病和阿尔茨海默氏病。目前测定神经突长出的方法依赖于对单个细胞的手工测定，或者采用复杂的图像分析方法，以确定神经突从细胞体长出的程度(Jiang，Z.G.等人，Brain Res Dev.Brain Res.，(1995)，85(2)，212-9；Patrick，C.W.等人，Exp.Neurol.，(1996)，138(2)，277-85)。在WO01/11340中描述了利用带有报告细胞位置的发光标记的报道分子和报告神经突长出的第二种发光标记报道分子的神经元细胞，来测定神经突长出的方法。通过数字成像来测定细胞上或细胞内第一种和第二种发光标记报道分子的分布、环境或活性的变化。这种方法尽管是对纯粹基于形态学分析的图像分析方法的改进，仍然需要复杂的分析步骤来测定两种发光报道分子的相对空间排列。至今，测定细胞运动的方法的建立通常是劳动密集型的，虽然设计了多种使用一次性成分和化学分析方法测定穿过屏障膜的细胞数量的变形方法(Frevert等人，J.Immunol.Methods，(1998)，213(1)，41-52)，但是这些方法不适于高通量的应用。成像法具有如下缺点，即由于必须收集足够的图像从而能够从一系列图像中的一个到下一个对单个细胞示踪，导致分析过程极其复杂。此外，由于哺乳动物细胞在培养时可达到1-2μm/分钟的相当大的相对运动速率，(Zicha等人，J.Cell Sci.，(1999)，112，447-454；Thurston和Palcic，Cell Motility and the Cytoskeleton，(1987)，7，361-367)，一个大小为10-20μm的单个细胞在10-30分钟内，可以很容易的运动到与其先前的位置不一致的位置。由于细胞迁移测定可以在数小时或更长的时间内进行，慢过程胶卷或录像纪录必须收集足够的信息来示踪所有细胞，以避免图像之间细胞的错误识别。此外，一旦得到图像，需要大量的人工分析或者复杂的软件来分析数据，并测定一群细胞中每个细胞的移位(Thurston等人，(1988)，在上述引文中；Thurston等人，(1986)，在上述引文中)。进行了一些尝试来简化检测，以使它们更适合于高通量自动操作。这些检测采用在标准培养或在膜屏障上培养的标记细胞的荧光强度测定(CrouchM.E，J.Neurosci.Methods，(2000)，104(1)，87-91)，测定穿过膜的荧光标记细胞的神经突的生长。这些检测单独采用荧光强度测定，可对神经突长出进行定量。然而，对标准培养物进行强度测定不能准确辨别荧光标记的神经元细胞体和神经突，导致神经突长出测定的不准确性。屏障法虽然可辨别细胞体和神经突，但存在与前述屏障细胞迁移法同样的检测方法建立的问题。前述方法以采用物理屏障和/或单个细胞识别来测定细胞形态学变化为特征。结果，它们对人工介入和/或分析努力要求很高，要结合复杂的仪器及软件，这排除大量并行的分析。因此，需要最小限度建立过程并适于高通量筛选及自动操作的方法，来测定细胞的形态学变化。本专利技术提供了一种测定细胞形态学特征变化，尤其是测定细胞位置和/或细胞形状变化的方法，该方法避免了需要物理屏障来隔离细胞群，而且还避免了对单个细胞进行示踪的需要。因此本专利技术提供的细胞分析方法可用于很宽范围的细胞类型及培养条件，其结果可采用现有的仪器进行分析。因此，本专利技术的第一方面，提供了一种，该方法包括a)将细胞群中的细胞亚群暴露于第一波长光，其中所述的细胞群采用当暴露于第一波长光时，能够从基本上不可检测状态转变为可检测状态的标记物质标记；b)在第一时间将所述细胞群的至少部分暴露于第二波长光，并检测所述标记物质的第一分布模式；和c)在第二时间将所述细胞群的所述部分暴露于第二波长光，并检测所述标记物质的第二分布模式；其中所述标记物质的所述第一与第二分布模式的差别，指示所述细胞形态学参数的变化。优选地，细胞形态学参数选定为细胞大小、细胞位置和/或细胞形状，并且所述标记物质在所述细胞亚群中的分布模式变化指示了细胞大小和/或位置和/或细胞形状的变化。在一个特别优选的实施例中，细胞形状的变化指示了神经突长出。因此，根据本专利技术的方法，可通过采用非检测状态的、但当受到合适的第一波长光照射时能够变成可检测状态的标记物质对细胞群进行标记，来实现细胞形态学参数的测定。当将标记细胞的亚群以预定模式暴露于合适的第一波长光时，可确定该细胞亚群，其中该亚群所覆盖的面积符合所采用的照射模式。随后采用选定的适合于检测标记物的第二波长的照射光检测至少部分细胞群，将仅仅显示那些标记物受到第一波长光照射过的细胞。按照步骤b)和c)采用第二波长光检测的部分细胞群，可以是i)整个细胞群，其中所有的细胞都暴露于第二波长光，并且标记物质的分布模式横过所有细胞进行记录，该检测可通过移去用于进行第一波长光照射的光模式装置来实现；或者，ii)细胞亚群，其中将用第一波长光照射过的同一细胞亚群暴露于第二波长光，并记录标记物质的分布模式，该检测可通过保留用于进行第一波长光照射的光模式装置的空间位置来实现，并采用该装置来施加第二波长光照射；或者，iii)细胞亚群，其中将用第一波长光照射过的不同细胞亚群暴露于第二波长光，并记录标记物质的分布模式，该检测可通过改变用于进行第一波长光照射的光模式装置的空间位置来实现，并采用该装置来施加第二波长光照射。根据本专利技术的方法，可用于可采用标准组织培养方法培本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种测定细胞形态学参数变化的方法，其包括：ａ）将细胞群中的细胞亚群暴露于第一波长光，其中所述的细胞群采用当暴露于第一波长光时，能够从基本上不可检测状态转变为可检测状态的标记物质标记；ｂ）在第一时间将所述细胞群的至少部分暴露于 第二波长光，并检测所述标记物质的第一分布模式；和ｃ）在第二时间将所述细胞群的所述部分暴露于第二波长光，并检测所述标记物质的第二分布模式；其中所述标记物质的所述第一与第二分布模式的差别，指示所述细胞形态学参数的变化。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：N托马斯，
申请(专利权)人：通用电气医疗集团英国有限公司，
类型：发明
国别省市：GB[英国]