一种检测盐霉素的方法及其专用酶联免疫试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种检测盐霉素的方法及其专用酶联免疫试剂盒。该检测盐霉素的酶联免疫试剂盒，包括盐霉素特异性抗体及包被原和酶标记物；所述包被原为盐霉素半抗原与载体蛋白的偶联物或抗抗体；所述酶标记物为酶标抗抗体或酶标盐霉素半抗原；当所述包被原为盐霉素半抗原与载体蛋白的偶联物时，所述酶标记物为酶标抗抗体；当所述包被原为抗抗体时，所述酶标记物为酶标盐霉素半抗原。本发明专利技术的方法操作简便、费用低廉、灵敏度高、能够现场监控且适合大量样本筛查的检测如动物肝脏、肌肉等盐霉素药物残留量。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种检测盐霉素的方法及其专用酶联免疫试剂盒。
技术介绍
盐霉素(Salinomycin Sodium Premix)属一种聚醚类兽用抗生素，对大多数革兰氏阳性菌和部分霉菌起抗菌作用，单独使用对鸡球虫病能发挥良好的预防效果。但使用盐霉素不可过量，过量使用将会在动物体内大量蓄积，并会使所食用动物中毒死亡，通过食物链而危及人类健康。2002年12月我国农业部公告第235号文规定盐霉素在所食用动物的肌肉中最高残留量为600μg/kg在皮肤、脂肪中的最高残留量为1200μg/kg在肝中的最高残留量为1800μg/kg。因此，检测盐霉素在动物性食品中的最高残留量是非常重要。目前，常用于盐霉素残留检测的方法主要有微生物法和仪器分析法。微生物检测法虽然经济、操作简便，但在样本中有其他微生物抑制剂存在时，其灵敏度和特异性受到限制；高效液相色谱分析法、气谱、气质联机法等单纯的仪器分析方法，虽然灵敏度高，但是样本前处理及测定操作烦琐，费用高，不适宜于大量样本筛查，可以作为残留的确证分析。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种检测盐霉素的方法及其专用酶联免疫试剂盒。本专利技术所提供的检测盐霉素的酶联免疫试剂盒，包括盐霉素特异性抗体及包被原和酶标记物；所述包被原为盐霉素半抗原与载体蛋白的偶联物或抗抗体；所述酶标记物为酶标抗抗体或酶标盐霉素半抗原；当所述包被原为盐霉素半抗原与载体蛋白的偶联物时，所述酶标记物为酶标抗抗体；当所述包被原为盐霉素抗抗体时，所述酶标记物为酶标盐霉素半抗原。所述盐霉素半抗原与载体蛋白的偶联物可通过将盐霉素半抗原和载体蛋白用混合酸酐法或活性酯法进行偶联得到；所述盐霉素半抗原是将盐霉素和对氨基苯甲酸通过缩合反应得到的。所述酶标记物的标记酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶，其中优选碱性磷酸酯酶；碱性磷酸酯酶标记抗抗体可采用现有技术中的多种方法如戊二醛法或过碘酸钠法将酶交联在抗抗体上；碱性磷酸酯酶标记的盐霉素半抗原可采用混合酸酐法将碱性磷酸酯酶与盐霉素半抗原偶联得到。所述盐霉素半抗原是将盐霉素和对氨基苯甲酸通过缩合反应得到的。所述盐霉素特异性抗体可为盐霉素单克隆抗体或盐霉素多克隆抗体；它们均是用盐霉素半抗原与载体蛋白的偶联物作为免疫原得到的；多克隆抗体可为鼠源、马源、羊源、兔源或豚鼠源抗体，所述盐霉素单克隆抗体为盐霉素鼠单克隆抗体，所述盐霉素多克隆抗体优选为盐霉素兔多克隆抗体。所述抗抗体为羊抗鼠或羊抗兔抗抗体。抗体工作液所用的抗体稀释液为是pH值8.2的0.05mol/L，含有5％甲醇的磷酸盐缓冲液。所述盐霉素鼠单克隆抗体优选为盐霉素的单克隆杂交瘤细胞株A-2-3 CGMCCNo.1609分泌的抗体。盐霉素的单克隆杂交瘤细胞株A-2-3 CGMCC No.1609已于2006年2月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)。以上抗体均可以用盐霉素半抗原与载体蛋白的偶联物作为免疫原按常规方法制备。所述载体蛋白可为鼠血清蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白或血蓝蛋白等常用载体蛋白；所述盐霉素半抗原与载体蛋白的偶联物可通过将盐霉素半抗原和载体蛋白用混合酸酐法进行偶联得到；所述盐霉素半抗原是将盐霉素和对氨基苯甲酸通过缩合反应得到的。为了更方便现场监控和大量样本筛查，所述试剂盒还包括盐霉素标准品溶液、显色剂、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液。所述标准品溶液为六个浓度梯度含有盐霉素药物的溶液，所用的盐霉素药物稀释液为含有5‰(质量浓度)N，N’-二甲基甲酰胺(DMF)，1％小牛血清(BSA)的磷酸盐缓冲液。所述浓缩洗涤液为pH7.4，0.01mol/L的含有0.8％～1.2％吐温20、1‰硫柳汞防腐剂的磷酸盐缓冲液。所述当标记酶为辣根过氧化物酶时，显色剂由显色液A液和显色液B液组成，显色液A液为过氧化氢或过氧化脲，显色液B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺，终止液为1～2mol/L硫酸或盐酸；当标记酶为碱性磷酸酯酶时，显色剂为4-硝基酚磷酸盐缓冲液，终止液为氢氧化钠缓冲液。所述浓缩复溶液可为含有5‰(质量浓度)N，N’-二甲基甲酰胺(DMF)，1％小牛血清(BSA)的0.01mol/L～0.05mol/L的磷酸盐缓冲液。所述包被缓冲液为pH9.6，0.1mol/L的碳酸盐缓冲液。所述封闭液是含有3～10％马血清、1％惰性蛋白的水溶液。所用的包被盐霉素抗原或抗抗体的载体物质可为聚苯乙烯、纤维素、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚丙烯、交联葡聚糖、玻璃、硅橡胶、琼脂糖凝胶等，载体的形式可以是试管、微量反应板凹孔、小珠、小圆片等。本专利技术所提供的检测盐霉素的方法，包括以下步骤1)样品前处理样品前处理称取2g动物组织匀浆物置离心管中，加入10ml体积比为4∶1的甲醇和5％生理盐水的混合液，剧烈振荡混匀；于15℃，5000g以上速度离心10min；将上清液移入另一离心管中，于15℃，3000g离心5min；取5ml上清液，加入10ml四氯化碳，振荡混匀，5000g以上速度离心10min；将上层液移入另一管中用氮气吹干，用1ml稀释4倍的浓缩复溶液溶解干燥的残留物，取水相进行分析。2)利用上述检测盐霉素的酶联免疫试剂盒检测样品。3)检测数据分析。盐霉素是小分子物质，只有免疫反应性，没有免疫原性，不能诱发机体产生免疫应答，必须与大分子载体蛋白偶联后才具有免疫原性。将盐霉素和对氨基苯甲酸通过缩合反应合成盐霉素半抗原，有助于制出针对盐霉素抗原特异性较强的多克隆抗体。再将盐霉素采用混合酸酐法与载体蛋白偶联得到免疫原。半抗原与载体蛋白的结合比例过低或过高都对免疫不利，半抗原与OVA、RSA和KLH的结合摩尔比分别为11∶1、17∶1、17∶1。本专利技术的试剂盒可定性、定量检测动物组织样品中盐霉素的残留量。本专利技术的检测原理是当微孔条上预包被盐霉素半抗原与载体蛋白的偶联物时，加入系列标准品或样品溶液和盐霉素抗体工作液后，样本中残留的盐霉素和微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗盐霉素的抗体，加入酶标记物进行酶活性放大作用，显色后终止；当微孔条上包被抗抗体时，加入盐霉素抗体工作液后，再加入系列标准品或样品溶液和酶标抗原，样品残留的盐霉素和酶标抗原竞争抗盐霉素抗体，显色；显色终止后用酶标仪测定每孔吸光度值(OD值)，样本吸光度值与其残留物盐霉素的含量呈负相关，与标准曲线比较即可得出相应残留物盐霉素的含量。也可根据酶标板上的样品溶液颜色的深浅，与系列浓度的盐霉素标准液颜色比较判断样品中盐霉素的浓度范围。本专利技术的检测盐霉素的酶联免疫试剂盒对样品的前处理要求低，样品前处理过程简单，能同时快速检测大批样品；主要试剂以工作液、浓缩液或冻干粉等形式提供，检验方法方便易行，经过对试剂盒的精密度和准确度测试实验表明，本专利技术的酶联免疫试剂盒具有高特异性、高灵敏度、高精确度、高准确度等特点，将在食品和饲料盐霉素残留量的检测中发挥重要作用。本专利技术的试剂盒结构简单、使用方便、价格便宜、便于携带，可用于动物源性食品中盐霉素的检测；本专利技术的检测盐霉素的方法高效、准确、简便、适于大批量样品筛选的定性、定量检测。附图说明图1为以盐霉素抗原为包被原的酶联免疫试剂盒盐霉素标准曲线2为以抗抗体为包被原的酶联免疫试剂盒盐霉素标准曲线图具体实施方式下述实施例的方法如本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测盐霉素的酶联免疫试剂盒，包括盐霉素特异性抗体及包被原和酶标记物；所述包被原为盐霉素半抗原与载体蛋白的偶联物或抗抗体；所述酶标记物为酶标抗抗体或酶标盐霉素半抗原；当所述包被原为盐霉素半抗原与载体蛋白的偶联物时，所述酶标记物为酶标抗抗体；当所述包被原抗抗体时，所述酶标记物为酶标盐霉素半抗原；所述盐霉素半抗原是将盐霉素和对氨基苯甲酸通过缩合反应得到的。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：沈建忠，何方洋，万宇平，史为民，冯才伟，江海洋，吴小平，汪善良，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]