本发明专利技术涉及一种具有依赖利福平生长的特异性结核分枝杆菌（其保藏号为：ＣＧＭＣＣ ＮＯ．１５７０）。还涉及依赖利福平结核分枝杆菌蛋白，其具有如序列１所示的氨基酸序列，其分子量为４３８９４道尔顿，ｐＩ值为５．２５。还涉及一种核酸，其具有如序列２所示的核苷酸序列。本发明专利技术还涉及采用人工诱导依赖利福平结核分枝杆菌，获得高表达浓度的所述依赖利福平结核分枝杆菌蛋白的方法。涉及包含所述依赖利福平结核分枝杆菌蛋白的组合物、试剂盒以及所述试剂盒在临床诊断依赖利福平结核分枝杆菌结核病、耐多药结核病及其流行病学监测调查中的应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种结核分枝杆菌蛋白，以及该蛋白在依赖利福平结核分枝杆菌的临床诊断和流行病学监测等方面的应用，及其该蛋白作为药物靶标在耐多药结核病治疗新药开发的应用。
技术介绍
2000年全国第四次结核病流行病学抽样调查结果显示我国约有500万结核病患者，五亿结核病感染者，结核病疫情仍然很严重。WHO估计，当今世界约有2/3的结核病患者处于发生耐药病例的危险之中。由于耐药菌，特别是耐多药菌的不断产生和传播，是当今结核病难以控制的关键。依赖利福平结核分枝杆菌(以下简称依R菌)。依R菌是本专利技术第一专利技术人首次在临床肺结核患者痰标本中，通过分枝杆菌罗氏培养的药敏试验结果菌落观察发现和研究报道的，具有依赖利福平(R)抗结核药物生长的特殊结核分枝杆菌。依R菌生物学特性主要表现为，在适宜的利福平浓度下其细菌生长旺盛，离开利福平生长不良或不能生长。如图1所示，同时发现在有R和无R条件下两种条件下生长细菌的蛋白质表达不同，前者有标志性高表达蛋白，如图4(c)所示。大量研究表明依R菌在有R和无R条件下生长的细菌其形态、结构、染色性、毒力和蛋白质表达等方面均有明显差异。而且，依R菌中有74.4％～100％为耐多药结核菌。依R菌肺结核具有病情重、耐多药、化疗效果差和预后不良的临床特征，比一般的耐药病例危害更大。依R菌产生与传播给结核病的控制又提出新的难题。目前各地报道的依R菌在分枝杆菌培养阳性后的药物敏感试验中的发生率为6％～17％，这对于我国是一个结核病高发病率的国家，数值是惊人的。目前，利福平是结核病初治化疗组合方案中的主要杀菌药，是初治结核病治疗的必选药物，其使用非常广泛。依R菌感染所导致的结核病如果再使用利福平，不但化疗将失败，而且可使病情恶化，是难治性结核病的产生和化疗失败的重要原因之一。因此，临床对依R菌结核病的早期诊断和有效治疗的需求都十分迫切。现有常规方法从分枝杆菌的分离培养到药物敏感实验，至少需要2个月左右的时间才能观察到致病菌是否存在药物依赖现象，而且现有方法只能针对痰菌培养阳性的肺结核病人，对半数以上的痰菌阴性肺结核和肺外结核病患者来讲，常规细菌学方法是根本无能为力的。因此，寻求一种快速简便和有效的方法用于依R菌结核病的诊断非常急迫。本专利技术通过大量研究发现，依R菌在试管内适宜浓度利福平的诱导下可高表达量(占总细菌蛋白的30-50％)产生一种特定氨基酸序列的细菌蛋白。并通过大量临床试验证实，该特定氨基酸序列的细菌蛋白具有免疫活性功能，用于依R菌结核病的血清学快速诊断具有高度的特异性和良好的敏感性。本专利技术的依R菌特定氨基酸序列的结核分枝杆菌蛋白，不仅是1种依R菌结核病的诊断蛋白，还可作为开发新的有效的耐多药结核病治疗的药物靶标。因为，大量研究发现依R菌中有74.4％～100％都为耐多药结核菌。
技术实现思路
专利技术简述本专利技术的目的是提供一种具有依赖利福平(以下简称依R)生长的特异性的结核分枝杆菌、编码结核分枝杆菌蛋白如序列2所示的核苷酸序列，以及诱导依R菌核苷酸序列表达的依R结核分枝杆菌蛋白的方法。本专利技术还包括所述依赖利福平结核分枝杆菌蛋白的试剂盒及其在临床诊断依赖利福平结核分枝杆菌结核病、耐多药结核病及其流行病学监测调查中的应用。本专利技术涉及的结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)，其具有依赖利福平生长的特异性，其保藏号为CGMCC NO.1570，保藏时间2005年12月19日，参据的菌株号为1219。本专利技术涉及的依赖利福平结核分枝杆菌蛋白，其具有如序列1所示的氨基酸序列，其分子量为43894道尔顿，pI值为5.25。本专利技术涉及一种核酸，其具有如序列2所示的核苷酸序列。本专利技术所指的依R菌结核分枝杆菌蛋白由序列2所示的核苷酸序列的核酸表达，所表达的蛋白的氨基酸序列如序列1所示。本专利技术的结核分枝杆菌蛋白通过典型依R结核分枝杆菌诱导的方法如下1)分离鉴定筛选临床典型依赖利福平结核分枝杆菌菌株(保藏号为CGMCC NO.1570，参据的菌株号为1219)2)在7H9液体培养基中，以利福平6～24μg/ml作为诱导浓度培养获得富含序列2蛋白的依R菌株；3)或在L-J固体培养基中以利福平50～300μg/ml作为诱导浓度培养获得富含序列2蛋白的依赖利福平结核分枝杆菌株；4)制备步骤2或3诱导后的依赖利福平结核分枝杆菌蛋白溶液；5)分离蛋白、回收、纯化和复性即获得依赖利福平结核分枝杆菌蛋白。本专利技术的结核分枝杆菌蛋白也可以利用序列2所示的核苷酸序列，通过常规基因工程方法表达氨基酸序列如序列1所示的蛋白。本专利技术涉及包含专利技术结核分枝杆菌蛋白的试剂盒。本专利技术涉及一种新的结核病快速诊断方法，包含依R结核分枝杆菌株的专利技术结核分枝杆菌蛋白直接诊断，以及用血清学试验来辅助诊断依R菌结核病和进行流行病学调查等。本专利技术的依R结核分枝杆菌特定氨基酸序列的结核分枝杆菌蛋白，不仅是一种依R结核分枝杆菌结核病的诊断蛋白，还可作为开发新的有效的耐多药结核病治疗的药物靶标。因为，大量研究发现依R结核分枝杆菌中有74.4％～100％都为耐多药结核菌。专利技术详述本专利技术公开了一种编码结核分枝杆菌蛋白的如序列2所示的核苷酸序列，其编码的结核分枝杆菌蛋白制备的方法，由该方法制备的包含序列1所示氨基酸序列的结核分枝杆菌蛋白，以及包含该专利技术蛋白的试剂盒。同时还公开了他们在依R菌结核病诊断和流行病学调查监测中的应用。另外，本专利技术的结核分枝杆菌蛋白不仅是一种依R菌的诊断蛋白，还可作为开发新的有效的耐多药结核病治疗的药物靶标。因为，大量研究发现依R菌中有74.4％～100％都为耐多药结核菌。本专利技术的结核分枝杆菌蛋白采用典型依R菌体外人工诱导编码基因表达的方法，可以获得高表达量的专利技术蛋白，如实施例2所叙述。该专利技术蛋白也通过基因工程的常规方法表达、回收和纯化，还可以使用蛋白合成仪器系统直接合成。优选采用人工诱导方法，因为该法简单有效，成本低，重要的是获得的蛋白具有良好的功能活性。同时，可以避免基因工程常规方法表达蛋白，在表达、回收和纯化等过程可能引起的抗原丢失和产物功能活性的降低及不忠实性增强的可能。本专利技术的一个实施方案涉及用上述方法制备的结核分枝杆菌蛋白组合的试剂盒。本专利技术所公开的依R菌结核病血清免疫学诊断试剂盒，是指包括本专利技术的结核分枝杆菌蛋白组配的成套检测试剂。该试剂盒用于依R菌结核病的快速辅助诊断，或用于依R菌结核病的流行病学调查和监测。该试剂盒的检测方式为单人份检测板系统，其试剂盒包含20～50个已装配好的密封检测板。本专利技术的结核分枝杆菌蛋白已预先固定在检测板中的膜上(可4～8℃干燥保存6月以上)。该试剂盒的其它组合检测试剂还包括封闭液、胶体金标记的羊抗人IgG抗体和PBS洗涤液，以及阳性和阴性质量控制血清等。该试剂盒在分离获得临床检测样品后，单样品抗体检测的时间只需数分钟即可完成。开展此项目的临床检测不需要特殊的仪器设备。其方法简单、快速、成本低，适于基层医疗单位推广应用。本试剂盒所能检测的生物样品可包括血清、脑脊液、尿掖和穿刺液等可能含有血清抗依R菌蛋白抗体的临床样本，优先选用血清样本。上述依R菌结核病血清免疫学诊断试剂盒中所用到的包含本专利技术结核分枝杆菌蛋白的所有试剂或试剂盒都包括在本专利技术的范围内。本专利技术的结核分枝杆菌蛋白，也本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种结核分枝杆菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ），其具有依赖利福平生长的特异性，其保藏号为：ＣＧＭＣＣＮＯ．１５７０，保藏时间：２００５年１２月１９日，参据的菌株号为：１２１９。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：钟敏，王易伟，娄乐山，钟明，
申请(专利权)人：重庆市肺科医院，
类型：发明
国别省市：85[中国|重庆]
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