检测新型冠状病毒的免疫层析试纸制造技术

本申请涉及一种检测新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的免疫层析试纸，所述试纸条包括基板，以及设置于基板的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫沿待检测液体样本流动方向依次固定粘贴于基板上，所述基板为PVC板；所述样品垫上涂覆有生物素标记的抗SARS‑CoV‑2 N蛋白单克隆抗体、生物素标记的血管紧张素转换酶2(ACE2)，所述结合垫上涂覆有亲和素交联的胶体金，所述硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线，检测线上包被抗SARS‑CoV‑2M蛋白单克隆抗体，质控线上羊抗鼠IgG。本申请所述免疫层析试纸实现了高灵敏度、高特异性、速度快、操作便捷的检测，可应用基层医院、社区中人群的大规模快速筛查。

【技术实现步骤摘要】
检测新型冠状病毒的免疫层析试纸
本专利技术涉及了免疫检测
，特别是涉及了一种检测新型冠状病毒的免疫层析试纸。
技术介绍
2019年年底暴发的新型冠状病毒肺炎，严重影响着全球公共卫生安全。2020年1月12日，世界卫生组织（WHO）正式将该新型冠状病毒命名为“2019-nCov”。2020年2月11日，WHO将该新型冠状病毒感染的肺炎命名为“COVID-19”。与此同时，国际病毒分类委员会冠状病毒研究小组（ICVT-CSG）将该病毒命名为“严重急性呼吸综合征冠状病毒2”（SARS-CoV-2）。迄今为止，虽然越来越多的候选药物已进入科研人员视野，大量临床试验正在全球开展，不过真正的新冠特效药迄今仍未出现。同时，新冠疫苗研发有了诸多新进展，多家企业进入新冠疫苗临床阶段，然而，距离临床应用、大范围接种还需要时间。目前而言，新型冠状病毒肺炎管控的有效手段仍是早发现、早隔离、早诊断、早治疗。因而，适用于大量人群的准确、快速、便捷的检测产品，仍是市场、公共卫生机构所迫切需要的。免疫层析试纸以其简单、经济、快速、灵敏度较高、特异性较强、所需样本量少、不需特制检测仪器等优势，是检测新型冠状病毒的较优选择。目前，已有多家公司、科研单位研发了免疫层析检测新型冠状病毒的免疫层析设备。如专利申请CN202010218543.6，其公开了一种用于检测新型冠状病毒的时间分辨荧光免疫层析试剂盒，微球标记垫上涂覆有微球标记的COVID-19单克隆抗体涂层，检测线上涂覆有COVID-19N蛋白单克隆抗体涂层。专利申请CN202010136067.3，其公开了一种用于快速检测新型冠状病毒N蛋白的免疫层析试剂盒，检测线上包被有一株抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体，标记物垫上包被有标记物标记的另一株抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体，标记物为荧光微球、胶体金、胶体硒、彩色乳胶或磁性微球。专利申请CN202010224758.9，一种新型冠状病毒COVID-19抗原荧光检测免疫层析试剂盒，结合垫上含有荧光微球标记的新型冠状病毒COVID-19Spike蛋白单克隆抗体，检测区包被T有与结合垫上的新型冠状病毒COVID-19Spike蛋白单克隆抗体不同表位的新型冠状病毒COVID-19Spike蛋白单克隆抗体。专利申请CN202010184382.3，结合垫上包被有胶体金标记的新型冠状病毒NP蛋白单克隆抗体，检测线上包被有新型冠状病毒NP蛋白单克隆抗体。虽然目前已存在检测新型冠状病毒的免疫层析装置，但是均采用了常规的标记形式，灵敏度仍有所欠缺。本专利技术提供了一种更为灵敏的免疫层析检测试纸，以其更准确的实现早期鉴别诊断。
技术实现思路
本专利技术提供一种检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的免疫层析试纸，实现了高灵敏度、高特异性、速度快、操作便捷的检测，可应用基层医院、社区中人群的大规模快速筛查。本专利技术所述一种检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的免疫层析试纸，所述试纸包括基板，以及设置于基板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫沿待检测液体样本流动方向依次固定粘贴于基板上。所述基板为PVC板。优选的，所述样品垫是经过样品垫处理液浸渍处理的玻璃纤维膜或无纺布，所述样品垫处理液含有0.1%-0.3%（v/v）Tween20、0.4%-0.6%（w/v）蔗糖、0.4%-0.7%（w/v）酪蛋白、0.5%-0.8%（w/v）BSA、0.5%-2%（w/v）NaCl，余量为超纯水，pH8.0。优选的，检测样品经样品稀释液稀释，所述样品稀释液为含有0.05%-0.3%（w/v）BSA和0.3%-0.7%（w/v）PEG2000的0.5MPBS溶液。优选的，结合垫经结合垫处理液浸泡烘干后，滴加金标抗体烘干，结合垫处理液含0.1％（v/v）Tween-20、5％（w/v）蔗糖、1％（w/v）BSA的0.01mol/LPBS溶液，pH7.2。优选的，检测样品包括鼻咽拭子、痰液、肺泡灌洗液、血液。在一个实施例中，样品垫上涂覆有生物素标记的抗SARS-CoV-2N蛋白单克隆抗体、生物素标记的血管紧张素转换酶2(ACE2)。结合垫上涂覆有亲和素交联的胶体金。每个亲和素能够结合4分子的生物素，由此使得检测信号放大。硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线，检测线上包被抗SARS-CoV-2M蛋白单克隆抗体，质控线上羊抗鼠IgG。生物素标记抗体或受体方法为：使用碳酸氢钠缓冲液使用将抗SARS-CoV-2N蛋白单克隆抗体或血管紧张素转换酶2(ACE2)稀释。BNHS用DMSO稀释至工作浓度。取稀释后的单克隆抗体或ACE2，按照单克隆抗体或ACE2与BNSH物质的量之比为l：15～1：50的比例加入BNSH，混匀后置于室温反应2h，之后在4℃下于PBS缓冲液中透析以进行纯化。亲和素交联胶体金的方法为：将胶体金溶液250ml加入25ml，0.1M，pH＝9.00碳酸盐缓冲液，再按照20μg/mL的量加入亲和素5.0mg，最后加入2％（w/v）BSA溶液25ml，形成亲和素胶体金复合物。在另一个实施例中，在EP管中将样品与生物素标记的抗SARS-CoV-2N蛋白单克隆抗体、生物素标记的血管紧张素转换酶2(ACE2)混合，孵育30min，之后，将混合液添加到样品垫上，结合垫上涂覆有亲和素交联的胶体金。硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线，检测线上包被抗SARS-CoV-2M蛋白单克隆抗体，质控线上羊抗鼠IgG。如以上两个实施例，含有SARS-CoV-2的样品经由样品垫流至结合垫，由于生物素、亲和素之间的相互作用形成：胶体金-亲和素--生物素标记的抗SARS-CoV-2N蛋白单克隆抗体--SARS-CoV-2、胶体金-亲和素--生物素标记的血管紧张素转换酶2(ACE2)--SARS-CoV-2。混合物继续流动，流至硝酸纤维素膜，检测线上抗SARS-CoV-2M蛋白单克隆抗体截留上述混合物，形成胶体金-亲和素--生物素标记的抗SARS-CoV-2N蛋白单克隆抗体--SARS-CoV-2--抗SARS-CoV-2M蛋白单克隆抗体、胶体金-亲和素--生物素标记的血管紧张素转换酶2(ACE2)--SARS-CoV-2--抗SARS-CoV-2M蛋白单克隆抗体。过量的胶体金-亲和素--生物素标记的抗SARS-CoV-2N蛋白单克隆抗体可涌动至质控线与羊抗鼠IgG结合。本专利技术创造性的使用了抗体、受体的组合用于结合新型冠状病毒SARS-CoV-2，使用另一株不同的抗体将反应复合物捕获，其结合新型冠状病毒SARS-CoV-2的不同抗原表位，能够准确的鉴定新型冠状病毒SARS-CoV-2，有效的避免漏检，使得假阴性率显著降低。同时，本专利技术采用了生物素-亲和素系统，其进一步提升了本专利技术的灵敏度。具体实施方式实施例1：重组抗原的制备参照CN202010105749.8专利申请，合成S蛋白、N蛋白、M蛋白，所述N蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，所述S蛋白的氨基本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的免疫层析试纸，所述试纸条包括基板，以及设置于基板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫沿待检测液体样本流动方向依次固定粘贴于基板上，优选的，所述基板为PVC板；所述样品垫上涂覆有生物素标记的抗SARS-CoV-2 N蛋白单克隆抗体、生物素标记的血管紧张素转换酶2 (ACE2)，所述结合垫上涂覆有亲和素交联的胶体金，所述硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线，检测线上包被抗SARS-CoV-2M蛋白单克隆抗体，质控线上羊抗鼠IgG。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的免疫层析试纸，所述试纸条包括基板，以及设置于基板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫沿待检测液体样本流动方向依次固定粘贴于基板上，优选的，所述基板为PVC板；所述样品垫上涂覆有生物素标记的抗SARS-CoV-2N蛋白单克隆抗体、生物素标记的血管紧张素转换酶2(ACE2)，所述结合垫上涂覆有亲和素交联的胶体金，所述硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线，检测线上包被抗SARS-CoV-2M蛋白单克隆抗体，质控线上羊抗鼠IgG。


2.根据权利要求1所述免疫层析试纸，其特征在于，所述样品垫是经过样品垫处理液浸渍处理的玻璃纤维膜或无纺布，所述样品垫处理液含有0.1%-0.3%（v/v）Tween20、0.4%-0.6%（w/v）...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘伟芳，
申请(专利权)人：广州德成生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44