一种扩增CAR-T细胞的方法技术

本发明专利技术提供一种扩增CAR‑T细胞的方法，包括将新鲜血液经抗凝剂抗凝裂解，接种，再提供CAR‑T细胞刺激扩增培养基，利用扩增培养基将所述初步诱导扩增，控制温度和时间，更加快速的获得CAR‑T细胞，从而实现了更加简单快捷的扩增方式，具有更强的扩增和分化能力，且细胞活力稳定，成活率高。

【技术实现步骤摘要】
一种扩增CAR-T细胞的方法
本专利技术涉及细胞扩增领域，特别涉及一种扩增CAR-T细胞的方法。
技术介绍
CAR-T细胞治疗最早的研究始于1989年，是嵌合抗原受体T细胞免疫疗法，英文全称ChimericAntigenReceptorT-CellImmunotherapy。这是一种治疗肿瘤的新型精准靶向疗法，近几年通过优化改良在临床肿瘤治疗上取得很好的效果，是一种非常有前景的，能够精准、快速、高效，且有可能治愈癌症的新型肿瘤免疫治疗方法。需要体外扩增调节性T细胞回输来参与改善疾病的进展，在体外培养以大量扩增CAR-T细胞，一般一个病人需要几千万，乃至几亿个CAR-T细胞，体重越大，需要细胞越多，然而体内存在的调节性T细胞数量很少，仅占正常人外周血CD4+T细胞中的5～10％，体外获取后数量少，纯度不高，细胞增殖能力低，尤其是患者在疾病的某些病程阶段调节性T细胞的不稳定性，给体外扩增增加难度。
技术实现思路
鉴于此，本专利技术提出一种扩增CAR-T细胞的方法，解决上述问题。本专利技术的技术方案是这样实现的：一种扩增CAR-T细胞的方法：包括以下步骤：S1、收集血液血样品，放入透析膜中调节pH值在6.8-7.3下经抗凝剂抗凝，裂解红细胞，离心获取单核细胞成分之后接种；S2、提供CAR-T细胞刺激扩增培养基，采用所述CAR-T细胞刺激扩增培养基对外周血单个核细胞进行重悬，得到细胞悬液；所述CAR-T细胞扩增培养基包括肌酸磷酸、焦磷酸、白细胞介素、巯基乙酸、角鲨烷、维生素C、免疫磁珠；S3、将细胞悬液接种到细胞培养容器中培养80～120h，得到初步诱导扩增的CAR-T细胞；S4、利用扩增培养基将所述初步诱导扩增的CAR-T细胞进行第二诱导扩增培养24～48h，以便得到分化的CAR-T细胞；S5、利用扩增培养基将所述初步诱导扩增的CAR-T细胞进行第三诱导扩增培养8～10h，获得扩增的CAR-T细胞。进一步的，所述血液样品是人的血样品，为新鲜采集或存储的脐带血、周边血或骨髓。进一步的，所述抗凝剂由以下重量份组成：羟乙磷酸四钠18～24份、乙二胺四乙酸二钠14～20份、肝素钠2～9份、蜗牛黏液0.3～0.8份、表儿茶素0.22～0.65份。进一步的，所述CAR-T细胞扩增培养基包括以下重量份原料：肌酸磷酸28～33份、焦磷酸11～22份、白细胞介素10～20份、巯基乙酸10～20份、角鲨烷3～9份、维生素C2～10份、免疫磁珠15～20份。进一步的，所述免疫磁珠为CD3/CD28抗体共表达的免疫磁珠。进一步的，所述白细胞介素浓度为500～700IU/mL。进一步的，所述巯基乙酸浓度为60～80μmol/L。进一步的，所述维生素C的浓度为200～800mM。进一步的，S3、S4、S5步骤中，细胞培养的温度为18～30℃。进一步的，所述S3步骤中，细胞培养容器为36孔板、48孔板或96孔板。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术的CAR-T细胞扩增方法，能显著的提高CAR-T细胞扩增效果，具有更强的扩增和分化能力；其中，使用的抗凝剂针对血样具有较好的抗凝效果，蜗牛黏液和羟乙磷酸四钠、乙二胺四乙酸二钠等能与血液中的钙离子结合成螯合物，使钙离子失去凝血作用，阻止血液凝固，肝素钠结合表儿茶素能加强抗凝血酶，灭活丝氨酸蛋白酶，阻止凝血酶的形成，从而达到较好的凝血效果；扩增培养基中的角鲨烷能充分提供营养基质，利于细胞扩增，结合扩增培养的温度和时间，更加快速的获得CAR-T细胞，从而实现了更加简单快捷的扩增方式，具有更强的扩增和分化能力，且细胞活力稳定，成活率高。具体实施方式为了更好理解本专利技术
技术实现思路
，下面提供具体实施例，对本专利技术做进一步的说明。本专利技术实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。本专利技术实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1一种扩增CAR-T细胞的方法：包括以下步骤：S1、收集新鲜采集脐带血，放入透析膜中调节pH值在6.8下经抗凝剂抗凝，裂解红细胞，离心获取单核细胞成分之后接种，所述抗凝剂由以下重量份组成：羟乙磷酸四钠20份、乙二胺四乙酸二钠17份、肝素钠7份、蜗牛黏液0.5份、表儿茶素0.40份；S2、提供CAR-T细胞刺激扩增培养基，采用所述CAR-T细胞刺激扩增培养基对外周血单个核细胞进行重悬，得到细胞悬液；所述CAR-T细胞扩增培养基包括以下重量份原料：肌酸磷酸30份、焦磷酸16份、白细胞介素15份、巯基乙酸15份、角鲨烷6份、维生素C6份、免疫磁珠17份，免疫磁珠为CD3/CD28抗体共表达的免疫磁珠，白细胞介素浓度为600IU/mL，巯基乙酸浓度为70μmol/L，维生素C的浓度为500mM；S3、将细胞悬液接种到36孔板的细胞培养容器中，在18℃培养80h，得到初步诱导扩增的CAR-T细胞；S4、利用扩增培养基将所述初步诱导扩增的CAR-T细胞在18℃培养24h进行第二诱导扩增培养，以便得到分化的CAR-T细胞；S5、利用扩增培养基将所述初步诱导扩增的CAR-T细胞在18℃培养8h进行第三诱导扩增培养，获得扩增的CAR-T细胞。实施例2一种扩增CAR-T细胞的方法：包括以下步骤：S1、收集新鲜采集脐带血，放入透析膜中调节pH值在7.3下经抗凝剂抗凝，裂解红细胞，离心获取单核细胞成分之后接种，所述抗凝剂由以下重量份组成：羟乙磷酸四钠20份、乙二胺四乙酸二钠17份、肝素钠7份、蜗牛黏液0.5份、表儿茶素0.40份；S2、提供CAR-T细胞刺激扩增培养基，采用所述CAR-T细胞刺激扩增培养基对外周血单个核细胞进行重悬，得到细胞悬液；所述CAR-T细胞扩增培养基包括以下重量份原料：肌酸磷酸30份、焦磷酸16份、白细胞介素15份、巯基乙酸15份、角鲨烷6份、维生素C6份、免疫磁珠17份，免疫磁珠为CD3/CD28抗体共表达的免疫磁珠，白细胞介素浓度为600IU/mL，巯基乙酸浓度为70μmol/L，维生素C的浓度为500mM；S3、将细胞悬液接种到36孔板的细胞培养容器中，在30℃培养120h，得到初步诱导扩增的CAR-T细胞；S4、利用扩增培养基将所述初步诱导扩增的CAR-T细胞在30℃培养48h进行第二诱导扩增培养，以便得到分化的CAR-T细胞；S5、利用扩增培养基将所述初步诱导扩增的CAR-T细胞在30℃培养10h进行第三诱导扩增培养，获得扩增的CAR-T细胞。实施例3一种扩增CAR-T细胞的方法：包括以下步骤：S1、收集新鲜采集脐带血，放入透析膜中调节pH值在7下经抗凝剂抗凝，裂解红细胞，离心获取单核细胞成分之后接种，所述抗凝剂由以下重量份组成：羟乙磷酸四钠20份、乙二胺四乙酸二钠17份、肝素钠7份、蜗牛黏液0.5份、表儿茶素0.40份；S2、提供CAR-T细胞刺激本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种扩增CAR-T细胞的方法，其特征在于：包括以下步骤：/nS1、收集血液血样品，放入透析膜中调节pH值在6.8-7.3下经抗凝剂抗凝，裂解红细胞，离心获取单核细胞成分之后接种；/nS2、提供CAR-T细胞刺激扩增培养基，采用所述CAR-T细胞刺激扩增培养基对外周血单个核细胞进行重悬，得到细胞悬液；所述CAR-T细胞扩增培养基包括肌酸磷酸、焦磷酸、白细胞介素、巯基乙酸、角鲨烷、维生素C、免疫磁珠；/nS3、将细胞悬液接种到细胞培养容器中培养80～120h，得到初步诱导扩增的CAR-T细胞；/nS4、利用扩增培养基将所述初步诱导扩增的CAR-T细胞进行第二诱导扩增培养24～48h，得到分化的CAR-T细胞；/nS5、利用扩增培养基将所述初步诱导扩增的CAR-T细胞进行第三诱导扩增培养8～10h，获得扩增的CAR-T细胞。/n

【技术特征摘要】
1.一种扩增CAR-T细胞的方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、收集血液血样品，放入透析膜中调节pH值在6.8-7.3下经抗凝剂抗凝，裂解红细胞，离心获取单核细胞成分之后接种；
S2、提供CAR-T细胞刺激扩增培养基，采用所述CAR-T细胞刺激扩增培养基对外周血单个核细胞进行重悬，得到细胞悬液；所述CAR-T细胞扩增培养基包括肌酸磷酸、焦磷酸、白细胞介素、巯基乙酸、角鲨烷、维生素C、免疫磁珠；
S3、将细胞悬液接种到细胞培养容器中培养80～120h，得到初步诱导扩增的CAR-T细胞；
S4、利用扩增培养基将所述初步诱导扩增的CAR-T细胞进行第二诱导扩增培养24～48h，得到分化的CAR-T细胞；
S5、利用扩增培养基将所述初步诱导扩增的CAR-T细胞进行第三诱导扩增培养8～10h，获得扩增的CAR-T细胞。


2.如权利要求1所述的一种扩增CAR-T细胞的方法，其特征在于：所述血液样品是人的血样品，为新鲜采集或存储的脐带血、周边血或骨髓。


3.如权利要求1所述的一种扩增CAR-T细胞的方法，其特征在于：所述抗凝剂由以下重量份组成：羟乙磷酸四钠18～24份、乙二胺四乙酸二钠14～20份、肝素钠2～9份、蜗牛黏液0.3～0.8份、表儿茶素0...

【专利技术属性】
技术研发人员：湛振键，齐国光，刘世豪，
申请(专利权)人：广东康盾生物工程技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44