一种预防新型冠状病毒微颗粒的制备方法及应用技术

本发明专利技术提供一种预防新型冠状病毒微颗粒制备方法及应用，涉及疫苗领域。具体地，所述制备方法包括以下步骤：1)构建过表达刺突(S)蛋白的重组质粒；2)将重组质粒包装成慢病毒颗粒；3)用慢病毒颗粒对成纤维细胞进行感染，得到表达S蛋白的工具性细胞；4)将得到的工具性细胞及培养液进行X线照射，收集放疗后的上清液，获得所需微颗粒和凋亡的工具性细胞碎片混合物；5)将得到的混合物进行离心、浓缩、纯化后，即得疫苗。本发明专利技术利用了放疗诱导工具细胞释放的微颗粒作为载体，可在过表达新型冠状病毒S蛋白的情况下，直接激活机体抗病毒免疫，产生抗新型冠状病毒的中和抗体。本发明专利技术可诱导机体产生高水平中和抗体免疫反应，同时具备良好的生物安全性。

【技术实现步骤摘要】
一种预防新型冠状病毒微颗粒的制备方法及应用
本专利技术涉及疫苗
，具体涉及一种预防新型冠状病毒微颗粒的制备方法及应用。
技术介绍
2019年新型冠状病毒肺炎疫情被世界卫生组织定义为国际突发公共卫生事件，该疾病是由新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染引起的一类急性呼吸道类传染病，其主要传播途径为呼吸道飞沫传播、气溶胶传播和接触传播，常见的症状有发热、咳嗽、气促和呼吸困难等，严重感染者可能出现严重急性呼吸综合征、肾衰竭甚至死亡。冠状病毒的直径通常在70-120nm之间，为含包膜的正链单股RNA病毒，其单股非节段性RNA基因组长度在26-32kb之间。冠状病毒为冠状病毒科正冠状病毒亚科，该亚科包括4个属(α、β、γ和δ)，通常仅α、β属对人类具有致病作用。新型冠状病毒为β属冠状病毒，其刺突(S)蛋白为三聚体结构，其中每个单体都有与细胞受体结合的位点。研究表明，S蛋白上的受体结构域可与人受体蛋白血管紧张素转化酶2(ACE2)相结合从而入侵细胞。由于感染新型冠状病毒后的康复患者体内缺乏免疫记忆反应，其中和抗体只能维持较短时间，这导致治愈患者还可能发生二次感染。因此，探索安全有效的疫苗来刺激机体产生免疫应答，形成抗病毒抗体和免疫记忆反应是战胜疫情最重要的措施之一。目前，新型冠状病毒疫苗研究主要集中在以下几个方向：1、基于新型冠状病毒刺突蛋白(S)的重组腺病毒疫苗；2、基于S蛋白的信使RNA(mRNA)疫苗；3、基于S蛋白的重组蛋白疫苗。其中重组腺病毒疫苗容易被免疫系统清除，影响其表达效率；mRNA疫苗由于mRNA本身稳定性较差，易被需要特殊载体包被以保护mRNA不被降解；而重组蛋白疫苗由于需要繁琐的表达和纯化过程，其成本昂贵，且需额外添加佐剂后才能发挥较强的效果。胞外微颗粒是细胞间传递物质信息的重要载体，在细胞受到内外刺激时，细胞膜通过出芽的方式产生直径为100-1000nm的磷脂双层膜结构。胞外微颗粒可负载多种生物信息分子，包括蛋白质、mRNA等。相比于传统的放疗是常用的肿瘤治疗手段之一，研究表明，放疗可以促进细胞释放胞外微颗粒，且放疗诱导细胞释放的微颗粒本身具备较强激活机体免疫反应的功能。但目前尚未有使用放疗诱导手段结合S蛋白过表达重组细胞载体促进胞外微颗粒制备疫苗研究的先例。因此有必要提供一种新型冠状病毒疫苗的制备方法，利用放疗诱导工具细胞释放的微颗粒作为载体，通过的免疫激活效应，在过表达新型冠状病毒S蛋白的情况下，直接激活机体抗病毒免疫。并通过验证通过放疗诱导工具细胞释放的含S蛋白的疫苗微颗粒产生新型冠状病毒抗体的性能，从而避免体外制备重组蛋白的纯化过程，促进新型冠状病毒疫苗的研究和产业化应用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于解决重组蛋白疫苗制备过程中由于需要繁琐的表达和纯化步骤，提供了一种预防新型冠状病毒微颗粒的制备方法及作为疫苗的应用。为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种预防新型冠状病毒微颗粒的制备方法，包括以下步骤：1.构建过表达S蛋白的重组质粒；2.将重组质粒包装成慢病毒颗粒；3.用慢病毒颗粒对工具性细胞进行感染，得到过表达S蛋白的工具性细胞；4.将得到的工具性细胞及培养液进行X线照射，收集放疗后的上清液，经浓缩、纯化，获得所需微颗粒和凋亡的工具性细胞碎片混合物；5.将混合物进行离心，收集所得微颗粒。进一步地，所述步骤1为，基于新型冠状病毒S蛋白质编码区合成人工基因，并插入质粒载体的多克隆位点中，以构建可过表达S蛋白的核心质粒；进一步地，所述步骤2中，包装慢病毒颗粒的过程使用psPAX2质粒和pMD2.G质粒；进一步地，所述步骤3中工具性细胞包括成纤维细胞系、血管内皮细胞系、人胚肾细胞系中的一种；进一步地，所述步骤4中X线放射剂量为2-20Gy；进一步地，所述步骤4中X线放射剂量为20Gy，X线能量为6MV，持续放疗后的第2-7天收集上清液；进一步地，所述步骤5中所述离心操作为：1000g，离心10min得第一上清液；所得第一上清液于14000g，离心2min得第二上清液；所得第二上清液于14000g，60min离心得微颗粒沉淀；进一步地，所述微颗粒为携载S蛋白的微囊泡结构，所述微囊泡结构的粒径为100-1000nm。本专利技术的另一个目的在于，提供了一种预防新型冠状病毒的疫苗，所述疫苗包含以上微颗粒制备方法获得的微颗粒。进一步地，所述疫苗可以负载免疫的佐剂。相比现有技术，本专利技术的有益效果为：1.该疫苗通过激活B淋巴细胞产生抗新型冠状病毒抗体以实现预防新型冠状病毒感染的目的，该疫苗不添加免疫佐剂，即可产生大量针对新型冠状病毒的特异性抗体；2.本专利技术通过制备过表达S蛋白的工具细胞，经X线放疗，制备负载S蛋白的放疗微颗粒，由此获得可激活机体产生大量新型冠状病毒中和抗体的新型冠状病毒疫苗，避免S蛋白的富集和纯化过程，提高疫苗产率并降低生产成本。3.本专利技术所得的预防新型冠状病毒微颗粒制备工艺简单，周期短，具备良好的生物安全性和生物相容性。【附图说明】为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。图1为本专利技术预防新型冠状病毒微颗粒的电镜图；图2为本专利技术预防新型冠状病毒微颗粒的粒径图；图3为稳转成纤维细胞S蛋白含量检测结果；图4为不同放疗剂量诱导工具细胞产生放疗微颗粒的蛋白定量结果；图5为本专利技术预防新型冠状病毒微颗粒S蛋白含量检测结果；图6为本专利技术预防新型冠状病毒微颗粒使小鼠体内产生的抗新型冠状病毒抗体含量检测结果；图7为过表达S蛋白的细胞裂解液与本专利技术中的疫苗微颗粒使小鼠体内产生的抗新型冠状病毒抗体含量检测结果；图8为本专利技术预防新型冠状病毒微颗粒给药过程中小鼠的体重统计图。【具体实施方式】以下实例用于说明本专利技术，但不限制本专利技术的范围。在不背离本专利技术精神和实质的前提下，对本专利技术的方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本专利技术的范围。本专利技术在使用X射线照射基因工程改造的成纤维细胞后，细胞将分泌富含新型冠状病毒S蛋白的微颗粒。所得到的微颗粒可诱发机体产出抗新型冠状病毒抗体。本专利技术中，预防新型冠状病毒微颗粒储存条件为4℃和7天以内。本专利技术所述的预防新型冠状病毒微颗粒结构如图1所示，粒径大小如图2所示。以下是本专利技术的实施例：1、构建重组质粒并包装成慢病毒颗粒感染工具细胞在Pubmed网站确定新型冠状病毒S蛋白质编码区基因序列：atgtttgtttttcttgttttattgccactagtctctagtcagtgtgttaatcttacaaccagaactcaattacc本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种预防新型冠状病毒微颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：/nS1.构建过表达S蛋白的重组质粒；/nS2.将重组质粒包装成慢病毒颗粒；/nS3.用慢病毒颗粒对工具性细胞进行感染，得到过表达S蛋白的工具性细胞；/nS4.将得到的工具性细胞及培养液进行X线照射，收集放疗后的上清液，获得所需微颗粒和凋亡的工具性细胞碎片混合物；/nS5.将混合物进行离心，收集沉淀即得预防新型冠状病毒微颗粒。/n

【技术特征摘要】
1.一种预防新型冠状病毒微颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.构建过表达S蛋白的重组质粒；
S2.将重组质粒包装成慢病毒颗粒；
S3.用慢病毒颗粒对工具性细胞进行感染，得到过表达S蛋白的工具性细胞；
S4.将得到的工具性细胞及培养液进行X线照射，收集放疗后的上清液，获得所需微颗粒和凋亡的工具性细胞碎片混合物；
S5.将混合物进行离心，收集沉淀即得预防新型冠状病毒微颗粒。


2.根据权利要求1所述的预防新型冠状病毒微颗粒的制备方法，其特征在于，所述步骤S1为，基于新型冠状病毒S蛋白质编码区合成人工基因，并插入质粒载体的多克隆位点中，以构建可过表达S蛋白的核心质粒。


3.根据权利要求2所述的预防新型冠状病毒微颗粒的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中，包装慢病毒颗粒的过程使用psPAX2质粒和pMD2.G质粒。


4.根据权利要求1所述的预防新型冠状病毒微颗粒的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中工具性细胞包括成纤维细胞系、血管内皮细胞系、人胚肾细胞系中的一种...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄浩，金红林，卢利森，万超，郑俊武，郑成武，卫路，洪磊，金秀妍，刘群，
申请(专利权)人：武汉圣润生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42