本发明专利技术涉及基因工程领域，尤其涉及一种犬细小病毒VP2蛋白重组抗原、其编码基因及其表达和应用，包括一种犬细小VP2蛋白重组抗原基因、由该基因编码的一种犬细小VP2蛋白重组抗原、一种表达犬细小VP2蛋白重组抗原的方法及其在制备胶体金中应用。本发明专利技术在大肠杆菌表达系统中重组表达了VP2蛋白，具有生产周期短，产量高，成本低，特异性好的优点；重组蛋白上的His标签有利于一步纯化达到较高的纯度，并且不需酶切即可表现较好地活性；以重组抗原可作为犬细小病毒胶体金检测试剂条的一部分，敏感性高，特异性好，稳定性好，操作简便，适合作为常规检测手段。
【技术实现步骤摘要】
一种犬细小病毒VP2蛋白重组抗原、其编码基因及其表达和应用
本专利技术涉及基因工程领域，尤其涉及一种犬细小病毒VP2蛋白重组抗原、其编码基因及其表达和应用。
技术介绍
犬细小病毒病是一种由犬细小病毒感染幼犬引起的急性传染病。临床上有两种表现型,出血性肠炎型以剧烈的呕吐、出血性肠炎和白细胞显著减少为主要特征;心肌炎型则以突然死亡为特征。无论那种类型的临床表现，均以发病率高、死亡率高和传染性强为特点，是危害养犬业最为严重的传染病之一，可造成严重的经济，因此犬细小病毒病的及时检测诊断显得尤为重要。由于犬细小病毒病存在与其他犬类疾病相似的临床症状，所以很难通过医学临床观察确诊CPV感染，需要通过分子层面的技术手段来确然病毒感染。目前已经建立的检测方法有ELISA、PCR、HA、HI等，ELISA不能分辨野菌感染和疫苗免疫效果，PCR敏感性高，但对设备要求高，HA和HI需要搭配使用且不方便，例如公开号为CN105803112A的“用于检测犬细小病毒的引物、探针和试剂盒及检测方法”，包括：上游检测引物CPV-F包括一种核苷酸序列；下游检测引物CPV-R包括另一种核苷酸序列。探针包括第三种核苷酸序列。试剂盒包括上述的引物和探针。该专利技术虽然灵敏度高，但是其对于设备的要求高，并且检测时间长，需要数小时才能检测出结果，并且标记稳定性较差，不适合用于常规检测手段。
技术实现思路
本专利技术是为了克服现有检测方法对设备要求高、检测时间长、不适合用于常规检测的缺点，提供一种犬细小病毒VP2蛋白重组抗原、其编码基因及其表达和应用，能够以该抗原为标记抗原用于胶体金检测试剂条的制备，标记技术敏感性高，特异性好，稳定性好，操作简便，适合作为犬细小病毒的常规检测手段。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种犬细小病毒VP2蛋白重组抗原基因，其序列如SEQIDNO.2所示。由上述基因编码的一种犬细小病毒VP2蛋白重组抗原，其特征是，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术选用VP2蛋白作为犬细小病毒的VP2蛋白作为胶体金技术中的标记抗原，其CPV的中和抗原位点位于VP2上，VP2是CPV的免疫原性蛋白，编码CPV的主要抗原决定簇，可诱导机体产生中和抗体。包含上述重组抗原基因的重组载体。作为优选，所述载体为大肠杆菌BL21表达载体。本专利技术重组蛋白基因由人工合成，所用的载体为pET30a，为卡那抗性，融合表达组氨酸标签，蛋白定位于细胞周质。包含上述抗原基因的重组菌株。一种表达犬细小VP2蛋白重组抗原的方法，包括以下步骤：（1）将上述的重组载体转化大肠杆菌BL21细胞，得重组菌株；（2）重组菌株在35-37℃、LB培养基中摇瓶培养至OD=0.5-0.7，加入0.8-1.2mMIPTG，在35-37℃、200-250rpm下诱导表达3-5小时；（3）诱导结束后离心回收、破菌取上清并纯化所表达的犬细小病毒VP2蛋白重组抗原。本专利技术的表达系统为大肠杆菌BL21表达系统，它具有周期短，费用低，表达量大等特点；为了使得重组蛋白更好的保持活性位点，本专利技术选择比较温和的培养和诱导条件，其表达时的诱导温度在35-37℃，诱导转速为200-250rpm，诱导的IPTG浓度为0.8-1.2mM，这样使得重组蛋白有了更加缓慢的表达，有充分的时间进行空间构象的形成。作为优选，所述破菌使用超声破碎的方式进行，条件为350-450w，超声2-4s，间隔4-8s，共150-200次；纯化方式为亲和层析，缓冲体系为pH=7.8-8.2的40-60mMTris、0.15-0.25MNaCl，洗脱液中另加0.0.4-0.6MImidazole；纯化结束后以与纯化时相同的缓冲体系透析3-5次并无菌过滤，用BCA法测定浓度。重组蛋白中本专利技术加入了His标签，一步纯化能够达到较高的纯度，并且在得到较高纯度的重组蛋白后不需要酶切也能表现出较好的活性，相比于使用酶切才能产生活性的重组蛋白来说，减少了步骤，降低了成本。上述蛋白重组抗原在制备胶体金检测试剂条中应用。作为优选，所述胶体金检测试剂条的制备方法如下：（1）在沸腾的纯水中加入氯金酸与柠檬酸三钠，继续加热沸腾10-20min后冷却至室温得到胶体金溶液；（2）在冷却后的胶体金溶液中加入K2CO3调节至pH=6.8-7.2，加入犬细小病毒VP2蛋白重组抗原，搅拌20-40min后加入BSA溶液，再次搅拌20-40min后离心取沉淀，将沉淀用金标稀释液稀释后浸泡玻璃纤维，冻干后得到金标垫；（3）用点膜稀释液稀释proteinA至0.8-1.2mg/mL，用相同稀释液稀释羊抗OspC-VlsE多抗至0.4-0.6mg/mL，将上述两种稀释之后的溶液划线至硝酸纤维素膜上，35-37℃烘干过夜，其中点膜稀释液为pH7.2-7.5的10-20mMPBS、0.8-1.2wt%蔗糖溶液；（4）将以上金标垫、包被好的硝酸纤维素膜及滤纸、聚酯板、样品垫等组装成胶体金检测试剂条。本专利技术制备得到的胶体金检测试剂条为间接法胶体金检测试剂条，相比于其他检测方式来说，具有方便快捷、特异敏感、稳定性强、不需要特殊设备和试剂、结果判断直观等优点，适合作为常规检测手段。作为优选，所述制备方法中：金标稀释液为pH=7.8-8.2的10-20mMTris、0.15-0.25MNaCl、0.5-1.5wt%BSA、0.1-0.2wt%TritonX-100、0.01-0.02wt%Proclin300溶液；氯金酸的加入量为0.01-0.02wt%，柠檬酸三钠的加入量为0.01-0.02wt%。综上所述，本专利技术具有以下有益效果：（1）在大肠杆菌表达系统中重组表达了VP2蛋白，具有生产周期短，产量高，成本低，特异性好的优点；（2）重组蛋白上的His标签有利于一步纯化达到较高的纯度，并且不需酶切即可表现较好地活性；（3）以重组抗原可作为犬细小病毒胶体金检测试剂盒的一部分，敏感性高，特异性好，稳定性好，操作简便，适合作为常规检测手段。附图说明图1是本专利技术试剂条检测结果，其中上面三条为阳性，下面三条为阴性。具体实施方式实施例1：含有犬细小病毒VP2蛋白基因表达载体的构建犬细小病毒VP2蛋白重组抗原是根据VP2（NCBISequenceID:BAB21028.2）的蛋白序列设计而成。根据氨基酸的序列，用大肠杆菌的密码子，反翻译成核苷酸序列，得到的核苷酸序列由上海捷瑞生物工程有限公司合成重组基因序列SEQIDNO.2，载体为pET30a。实施例2：含有犬细小病毒VP2蛋白重组抗原的表达将犬细小病毒VP2蛋白质粒转化至大肠杆菌BL21中，涂布于含50ug/mL卡那霉素(上海生工，货号:K0408)的LB平板上，37℃过夜培养，挑取单克隆菌落，用含有相同浓度的卡那霉素的300mLLB培养基37℃培养至OD600达0.6左右，用终浓度为1mM本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种犬细小病毒VP2蛋白重组抗原基因，其特征是，所述的重组抗原基因序列如SEQID NO.2 所示。/n
【技术特征摘要】
1.一种犬细小病毒VP2蛋白重组抗原基因，其特征是，所述的重组抗原基因序列如SEQIDNO.2所示。
2.由权利要求1所述基因编码的一种犬细小病毒VP2蛋白重组抗原，其特征是，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。
3.包含权利要求1所述的重组抗原基因的重组载体。
4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征是，所述载体为大肠杆菌BL21表达载体。
5.包含权利要求1所述抗原基因的重组菌株。
6.一种表达犬细小VP2蛋白重组抗原的方法，其特征是，包括以下步骤：
（1）将权利要求4所述的重组载体转化大肠杆菌BL21细胞，得重组菌株；
（2）重组菌株在35-37℃、LB培养基中摇瓶培养至OD=0.5-0.7，加入0.8-1.2mMIPTG，在35-37℃、200-250rpm下诱导表达3-5小时；
（3）诱导结束后离心回收、破菌取上清并纯化所表达的犬细小病毒VP2蛋白重组抗原。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征是，所述破菌使用超声破碎的方式进行，条件为350-450w，超声2-4s，间隔4-8s，共150-200次；纯化方式为亲和层析，缓冲体系为pH=7.8-8.2的40-60mMTris、0.15-0.25MNaCl，洗脱液中另加0.4-0.6MImidazole；纯化结束后以与纯化时相同的缓冲体系透析3-5次并无菌过滤，用BCA法测定浓度。
【专利技术属性】
技术研发人员：吴晓杰，金继祖，吴银飞，
申请(专利权)人：杭州傲锐生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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