本发明专利技术提供一种乏氧荧光成像探针及其制备方法和应用，所述乏氧荧光成像探针具有式I所示结构，命名为：1‑(1‑(2‑硝基咪唑)‑3‑[(4‑氨甲基)氮杂环己烷]‑2‑丙醇)‑6‑(4‑硝基苯并‑2‑氧杂‑1,3‑二唑)‑赖氨酸，简称PLN；本发明专利技术的探针可以通过硝基咪唑基团实现该探针对不同乏氧环境中细胞内的大分子结合不同来实现对乏氧细胞的特异性荧光成像，分子中的伯氨基有利于该分子的进一步修饰。
【技术实现步骤摘要】
一种乏氧荧光成像探针及其制备方法和应用
本专利技术属于化学成像
，涉及乏氧荧光成像探针及其制备方法和应用。
技术介绍
乏氧是绝大部分实体瘤中的普遍现象，与肿瘤的发生、发展、转移和耐药存在密切联系(J.Natl.CancerI.2007,99(19),1441-1454.)。2019年诺贝尔生理与医学奖授予其相关因子(HIF-1α)的发现者。因此，如何实现乏氧细胞的成像对肿瘤诊疗非常重要。由于缺乏氧气的竞争，硝基咪唑及其衍生物可以被乏氧细胞内部的硝基还原酶还原为羟胺咪唑，其对位可与细胞内部含巯基的大分子发生不可逆加成反应，形成加合物，从而滞留在细胞内部，达到与乏氧细胞特异性结合的特点(Gynecol.Oncol.1998,71(2),270-277.)。CN109678993A公开了一种可逆乏氧-常氧循环检测的内标比率型纳米荧光探针，该荧光探针是内标信号单元R和乏氧检测单元铂卟啉通过聚乙烯基吡咯烷酮连接，具有如下结构：其中R为对氧不响应的基团，聚乙烯基吡咯烷酮的聚合度n在150-200之间。然而该探针位聚合物形式，且结构复杂。在本领域中期望能够开发出分子结构更为简单的乏氧荧光成像探针，以满足细胞特异性成像的要求。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种乏氧荧光成像探针及其制备方法和应用。本专利技术的乏氧荧光成像探针结构简单，能够实现对乏氧细胞的特异性荧光成像，并且终产物仍留有赖氨酸的一个伯氨基，有利于该分子后期与纳米颗粒等相结合，构建多功能化的乏氧响应诊疗剂。为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：一方面，本专利技术提供乏氧荧光成像探针，所述乏氧荧光成像探针具有如下式I所示结构：在本专利技术中，该荧光探针分子式为C24H34N10O7，分子量为574.26，被命名为：1-(1-(2-硝基咪唑)-3-[(4-氨甲基)氮杂环己烷]-2-丙醇)-6-(4-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑)-赖氨酸，是一种橘红色粉末，英文名为：1-(1-(2-nitroimidazole)-3-[(4-aminomethyl)azacyclohexane]-2-propanol)-6-(4-nitro-2,1,3-benzoxadiazole)-lysin。在本专利技术中，所述乏氧荧光成像探针结构简单，能够实现对乏氧细胞的特异性荧光成像，并且其结构上保留了赖氨酸的一个伯氨基，有利于后期进行结构修饰或者可以将该分子后期与一些纳米颗粒等材料相结合，构建多功能化的乏氧响应诊疗剂，满足一种探针发挥多种功能的目的。另一方面，本专利技术提供了如上所述的乏氧荧光成像探针的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：(1)将fmoc基团保护的赖氨酸(fmoc-lys)溶解在第一混合溶剂中，使其与4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑(NBD)接触，得到式Ⅱ所示化合物(fmoc-lys-NBD)；(2)在第二溶剂中，使碳二亚胺缩合剂、酰化活化剂和式Ⅱ所示化合物以及式A所示哌莫硝唑接触，得到式Ⅲ所示的化合物fmoc-(pimonidazole)-lys-NBD(fmoc-PLN)；(3)在第三有机溶剂中，使式Ⅲ所示的化合物发生fmoc脱保护反应，分离纯化后，得到式Ⅰ所示的终产物：pimonidazole-lys-NBD(PLN)。在本专利技术中所使用的术语“接触”应做广义理解，其可以是任何能够使得至少两种反应物发生化学反应的方式，例如可以是将两种反应物在适当的条件下进行混合。根据需要，可以在搅拌下，将需要进行接触的反应物进行混合，由此，搅拌的类型并不受特别限制，例如可以为机械搅拌，即在机械力的作用下进行搅拌。优选地，步骤(1)所述fmoc基团保护的赖氨酸与4-氯-7硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑的摩尔比为1:0.5-10，例如1:0.5、1:0.8、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10等，优选1:1。优选地，步骤(1)所述第一混合溶剂为甲醇和水的混合物或者DMF和有三乙胺的混合物，优选甲醇和水的混合物，所述甲醇和水的体积比为6:5。优选地，步骤(1)所述接触的温度为10-35℃，例如10℃、15℃、18℃、20℃、23℃、25℃、30℃或35℃等。优选地，步骤(1)所述接触的时间为6-24小时，例如6小时、8小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时或22小时，优选12小时。以TLC(薄层板)监测反应物消失情况来确定反应终点。优选地，步骤(1)还包括将fmoc基团保护的赖氨酸(fmoc-lys)加入第一混合溶剂后，用碳酸钠调节反应液pH值至9-10，例如9、9.3、9.5、9.8或10等。优选地，步骤(1)还包括所述接触后，将最终反应液pH调为酸性，收集析出沉淀，并用饱和食盐水将pH值洗回中性，将粗产物真空干燥后，溶于甲醇与水的混合溶剂，并使用高效液相分离纯化。优选地，所述将最终反应液pH调为酸性时所用的pH调节剂为盐酸，优选为1M的盐酸。在本专利技术中，所述使用高效液相分离纯化时，使用乙腈和水为洗脱液，以20：80(V/V)为初始梯度，100：0(V/V)为终止梯度进行梯度淋洗。所述梯度淋洗时间优选为20-40min，例如20min、23min、25min、28min、30min、33min、35min、38min或40min。优选地，步骤(2)所述第二溶剂为二甲基亚砜和甲醇的混合物、二氯甲烷和甲醇的混合物、N,N'-二甲基甲酰胺(DMF)与甲醇的混合物或者N,N'-二甲基甲酰胺，优选N,N'-二甲基甲酰胺与甲醇的混合物，所述N,N'-二甲基甲酰胺与甲醇的体积比优选为10:0-5，例如可以为10:0(在甲醇体积为0时，所述溶剂即为N,N'-二甲基甲酰胺)、10:1、10:2、10:3、10:4或10:5等。优选地，所述碳二亚胺缩合剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和/或N,N'-二环己基碳二亚胺。优选地，所述酰化活化剂为N-羟基琥珀酰亚胺和/或1-羟基苯并三唑。优选地，式Ⅱ所示化合物与哌莫硝唑的摩尔比为1:1-2，例如1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9或1:2。优选地，所述哌莫硝唑与酰化活化剂的摩尔比为1:1-5，例如1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5或1:5。优选地，所述哌莫硝唑与碳二亚胺缩合剂的摩尔比为1:1-5，例如1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5或1:5。优选地，步骤(2)所述接触的温度为20-40℃，例如20℃、23℃、25℃、28℃、30℃、33℃、35℃、38℃或40℃。优选地，步骤(2)所述接触的时间为8-24小时，例如8小时、9小时、10小时、12小时、14本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种乏氧荧光成像的探针，其特征在于，所述乏氧荧光探针具有如下式I所示结构：/n
【技术特征摘要】
1.一种乏氧荧光成像的探针，其特征在于，所述乏氧荧光探针具有如下式I所示结构：
2.根据权利要求1所述的乏氧荧光成像的探针的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将fmoc基团保护的赖氨酸(fmoc-lys)溶解在第一混合溶剂中，使其与4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑接触，得到式Ⅱ所示化合物；
(2)在第二溶剂中，使碳二亚胺缩合剂、酰化活化剂和式Ⅱ所示化合物以及式A所示哌莫硝唑接触，得到式Ⅲ所示的化合物；
(3)在第三有机溶剂中，使式Ⅲ所示的化合物发生fmoc脱保护反应，分离纯化后，得到式Ⅰ所示的乏氧荧光探针。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述fmoc基团保护的赖氨酸与4-氯-7硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑的摩尔比为1:0.5-10；
优选地，步骤(1)所述第一混合溶剂为甲醇和水的混合物或者DMF和有三乙胺的混合物，优选甲醇和水的混合物，所述甲醇和水的体积比为6:5。
4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述接触的温度为10-35℃；
优选地，步骤(1)所述接触的时间为6-24小时。
5.根据权利要求2-4中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)还包括将fmoc基团保护的赖氨酸加入第一混合溶剂后，用碳酸钠调节反应液pH值至9-10；
优选地，步骤(1)还包括所述接触后，将最终反应液pH调为酸性，收集析出沉淀，并用饱和食盐水将pH值洗回中性，将粗产物真空干燥后，溶于甲醇与水的混合溶剂，并使用高效液相分离纯化；
优选地，所述将最终反应液pH调为酸性时所用的pH调节剂为盐酸，优选为1M的盐酸；
优选地，所述使用高效液相分离纯化时，使用乙腈和水为洗脱液，以20：80体积比为初始梯度，100:0体积比为终止梯度进行梯度淋洗；
优选地，所述梯度淋洗时间优选为20-40min。
6.根据权利要求2-5中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述第二溶剂为二甲基亚砜和甲醇的混合物、二氯甲烷和甲醇的混合物、N,N'-二甲基甲酰胺与甲醇的混合物或者N,N'-二甲基甲酰胺，优选N,N'-二甲基甲酰胺与甲醇的混合物，所述N,N'-二甲基甲酰胺与甲醇的体积比优选为10:0-5；
优选地，所述碳二亚胺缩合剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和/或N,N'-二环己基碳二亚胺；
优选地，所述酰化活化剂为N-羟基琥珀酰亚...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈春英，周会鸽，李佳阳，郭梦雨，
申请(专利权)人：国家纳米科学中心，
类型：发明
国别省市：北京;11
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