乙型肝炎病毒前S2抗原化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种检测乙型肝炎病毒前Ｓ２抗原的测定试剂盒及其制备方法。本发明专利技术所提供的试剂盒包括：校准品、亲和素包被的固相载体、生物素化的抗体、抗－ＨＢｓ标记物、化学发光底物和浓缩洗涤液。本发明专利技术的试剂盒按以下步骤制备：１）以乙肝病毒前Ｓ２抗原纯品配制校准品；２）以亲和素包被固相载体；３）使乙肝病毒前Ｓ２抗原的单克隆抗体生物素化；４）以标记物标记抗－ＨＢｓ单克隆抗体；５）配制化学发光底物；６）配制浓缩洗涤液；７）分装上述校准品、标记物、化学发光底物和洗涤液；以及８）组装为成品。本发明专利技术的试剂盒具有灵敏度高、特异性强、检测速度快、操作简便、重复性好等优点，可以非常专一地检测出感染乙型肝炎病毒后人体中的乙型肝炎病毒前Ｓ２抗原的含量，作为乙肝诊断、预后的辅助手段。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及免疫分析医学领域，具体地，本专利技术提供了一种生物素-亲和素间 接包被技术结合化学发光免疫分析技术测定乙型肝炎病毒前S2抗原(HBV Pre-S2 Ag)试剂盒及其制备方法。
技术介绍
乙型肝炎(H印atitis B, HB)是全球流行最广的病毒性感染疾病之一，'是由 乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)引起的、以肝脏炎性病变为主并可引 起多器官损害的一种流行久远、传播广泛、危害严重的传染病。迄今为止，乙型肝炎病毒感染的治疗尚未有突破性的进展，由HBV造成的大 众健康问题也远没有得到解决。因此，乙型肝炎已成为严重威胁人类生命健康的 世界性疾病，对乙型肝养的防治已成我国健康与传染性疾病控制中的首要问题。乙型肝炎病毒(HBV)基因组全长仅为3200碱基，以部分环状双链存在。其 中负链为完整的环链，包括4个相互重叠的阅读框前C/C区、S区、P区和X区。S区由前S1基因、前S2基因以及S基因组成，分别编码3种蛋白，即编码由 409个氨基酸组成的大分子量蛋白(L蛋白或前Sl蛋白)、由285个氨基酸组成的 中分子量蛋白(M蛋白或前S2蛋白)、由226个氨基酸组成小分子量主蛋白(S蛋白)。 前C/C基因，编码HBeAg和HBcAg。 P区最长，约占基因组75°/。以上，编码HBV DNA 多聚酶。X区(核苷酸1， 374 ~ 1, 835 )可能编码有154个氨基酸的碱性多肽，长 链的裂口位于此区。1992年日本学者用血凝法发现在乙肝患者血液中有一种物质能和聚人血清白 蛋白(PHSA)结合。进一步研究证实，该物质是乙肝病毒外壳的一种成分，即前 S2。临床资料证实，HBV活跃复制时，前S2滴度增高，反之呈低滴度或阴性。急性乙肝时，若前S2消失早，抗前S2出现早，则病人多数瘙愈，反之则提示慢性 化的可能。乙型肝炎病毒前S2抗原实验室检测主要为免疫分析，包括放射免疫分析 (RIA)、酶联免疫分析(ELISA)以及间接凝集法等方法，其中ELISA是目前临 床诊断市场的主流;险测方法。ELISA检测方法具有操作简便、易普及等优势，但其 酶标记物底物大多有毒或为致癌物，而且不稳定，其灵敏度难以满足临床市场的 高灵敏要求。虽然RIA ;f企测方法灵敏度高，但其有效期短、存在放射性废弃物污 染等缺点同样也难以满足目前临床诊断市场的要求。近几年来，快速发展的化学 发光免疫分析(Cherailurainescene CLIA)是一种无放射性的超孩i量免疫分析新技 术，它继承了 RIA和ELISA的所有优点，同时克服了二者共同的缺点，具有灵敏 度高，特异性强，精密度好，线性范围宽，方法稳定、快速等优点，成为放射性 免疫分析与普通酶免疫分析的取代者，是目前免疫定量分析最理想的方法。亲和素-生物素系统在ELISA中的应用有多种形式，其中包括反应信号放大、 间接包被等形式。反应信号放大即为生物素化的抗原或抗体与酶标记的亲和素反 应体系，其优点是利用生物素-亲和素放大效应提高检测灵敏度，缺点为亲和素的 等电点较高，对聚苯乙烯等固相载体有较高的非特异吸附而导致较高的本底。本 专利技术以亲和素包被固相载体，通过亲和素-生物素系统间接包被生物素化的抗体， 不仅便于放大生产、易于监控生产过程，而且避免了直接包被固相存在的活性损 失大、工艺优化繁瑣等缺点，同时保证了批次间的稳定性。本专利技术的目的是为了解决目前临床上放免试剂有效期短、放射性废弃物污染 危害以及酶免试剂灵敏度低、精密性差等不足。本专利技术的乙型肝炎病毒前S2抗原 化学发光测定试剂盒，经临床实验证明，操作简便，灵敏度高，特异性好，与PCR 检测乙型肝炎病毒DNA结果符合度极高，可以在蛋白水平上为监控乙肝病毒复制 提供辅助诊断，为尽早采取有效综合治疗方案、预防肝硬化和肝癌的发生提供诊 断依据。
技术实现思路
本专利技术将生物素-亲和素间接包被技术、化学发光技术与乙型肝炎病毒前S2 抗原的免疫分析有效地结合，提供了一种灵敏度高、特异性强、检测速度快、操 作简便、重复性好的乙型肝炎病毒前S2抗原检测试剂盒。本专利技术的目的是提供一种生物素-亲和素间接包被技术结合化学发光免疫分 析测定乙型肝炎病毒前S2的试剂盒。本专利技术的试剂盒由乙型肝炎病毒前S2抗原校准品、亲和素化的固相载体、生 物素化的乙型肝炎病毒前S2抗原的单克隆抗体、抗-HBs单克隆抗体标记物、化学 发光底物以及浓缩洗涤液组成。根据本专利技术的试剂盒，其中，所述固相载体为微孔板、塑料管或磁性颗粒； 所述标记物为碱性磷酸酶或化学发光剂，其中所述化学发光剂为吖啶酯、鲁米诺 或异鲁米诺；所述化学发光底物为1，2-二氧乙烷类衍生物、过氧化脲或过氧化氢， 其中所述1,2-二氧乙烷类衍生物为(金刚烷)-1,2-二氧乙烷、3-(2'-螺旋金刚 烷)-4-曱氧基-4-(3〃 -磷酰氧基)苯基-l, 2-二氧乙烷(AMPPD) 、 CSPD或CDP-Star。本专利技术的另 一 目的为提供了上述试剂盒的制备方法。亲和素包被固相栽体的方法为用0. 050M pH值为9.6的碳酸盐緩沖液配制 成所需浓度的亲和素包被液，并将包被液负载于固相载体上，用生理盐水洗涤， 10%山羊血清封闭后，抽湿干燥，铝箔袋密闭，低温保存。其中，所述包被亲和素 的固相载体为微孔板、塑料管或磁性颗粒。用戊二醛法将碱性磷酸酶或化学发光剂与抗-HBs单克隆抗体偶联，其中所述 化学发光剂为吖啶酯、鲁米诺或异鲁米诺。用1，2-二氧乙烷类衍生物、过氧化脲或过氧化氢配制化学发光底物，其中所 述1,2-二氧乙烷类衍生物为(金刚烷)-1，2-二氧乙烷、3-(2'-螺旋金刚烷)-4-曱 氧基-4-(3〃 -磷酰氧基)苯基-l, 2-二氧乙烷、CSPD或CDP- Star。浓缩洗涂液的配方为含16% NaCl、 0. 4% KC1的0. 2M pH7. 4 Tris-HC1 H冲液。本专利技术的试剂盒采用亲和素-生物素间接包被技术与化学发光技术相结合，避 免了直接物理吸附存在免疫活性损失大、空间位阻、精密性差等缺点，而且简化 工艺优化、便于监控生产过程。本专利技术的试剂盒利用亲和素-生物素系统间接包被前S2抗体，与待测样本中 前S2抗原反应形成固相亲和素-生物化前S2抗体-前S2抗原复合物，再与碱性磷 酸酶标记的抗-HBs反应形成固相亲和素-生物素化前S2抗体-前S2抗原-^s威性磷酸 酶标记抗-HBs夹心复合物，催化底物化学发光，定量分析反映血清中乙型肝炎病 毒前S2的含量，避免了辣根过氧化物酶标记物催化的化学发光反应平台期短、化 学发光底物不稳定的缺点。本专利技术的试剂盒也可利用亲和素固相，与生物素化单抗和待测样本中前S2抗 原反应形成固相亲和素-生物化抗体-前S2抗原复合物，再与吖吱酯标记的抗-HBs 反应形成固相亲和素-生物素化抗体-前S2抗原-吖啶酯标记抗-HBs夹心复合物， 然后加入化学发光底物，利用化学发光仪检测相对发光强度，定量分析反映血清 中乙型肝炎病毒前S2的含量，进而体现乙型肝炎病毒的感染水平。从而避免了酶 免试剂存在的灵敏度低、内源性酶干扰、底物大部分有毒或致癌等缺点，具有反 应速度快、光信号不受温度变化影响、成本低、易储存等优势。本专利技术的试剂盒 可以非常专一地检测出感染乙型肝炎病本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种乙型肝炎病毒前Ｓ２抗原化学发光免疫分析测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由乙型肝炎病毒前Ｓ２抗原校准品、亲和素化的固相载体、生物素化的乙型肝炎病毒前Ｓ２抗原的单克隆抗体、抗－ＨＢｓ单克隆抗体标记物、化学发光底物、以及浓缩洗涤液组成。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：彭京胜，应希堂，宋胜利，胡国茂，郑金来，唐宝军，
申请(专利权)人：北京科美东雅生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]