胰岛素自身抗体化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术涉及免疫分析医学领域，具体地，本发明专利技术提供了一种采用生物素－亲和素系统的胰岛素自身抗体化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法。根据本发明专利技术的试剂盒包括：阴性和阳性对照品；样品稀释液；亲和素化的固相载体；生物素化的胰岛素抗原；碱性磷酸酶标记的羊抗人ＩｇＧ抗体；化学发光底物和浓缩洗涤液。进一步，根据本发明专利技术制备上述试剂盒的方法包括以下步骤：配制阴性和阳性对照品；配制样品稀释液；以亲和素包被固相载体；使胰岛素抗原生物素化；以碱性磷酸酶标记羊抗人ＩｇＧ抗体；配制化学发光底物；配制浓缩洗涤液；分装上述各组分并组装为成品。本发明专利技术的试剂盒具有简便、快速、灵敏、稳定等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及免疫分析医学领域，具体地，本专利技术提供了一种采用生物素-亲和 素系统的胰岛素自身抗体化学发光免疫分析定性测定试剂盒及其制备方法。
技术介绍
胰岛素自身抗体(Insulin autoantibodies, IAA)是胰岛素依赖型糖尿病 (Insulin-d印endent diabetes mellitus， IDDM)或称I型糖尿病个体的一种特 异性免疫学标志物，IDDM是由于胰腺中的e细胞遭到免疫破坏，最终导致胰岛素分泌不足引起的。在有患iD函基因倾向的个体中，对e细胞的免疫性破坏发生于一个无症状的时期，这个时期被称为糖尿病前期，在IDDM的临床诊断之前，糖尿 病前期就已经存在多年，在这个时期，人体血清中可检测出胰岛素自身抗体和胰岛 细胞抗体。因此，检测胰岛素自身抗体对于IDDM的早期诊断具有重要的临床意义。目前，胰岛素自身抗体的检测方法主要有放射免疫分析(RIA)和酶免疫分 析(EIA)。放射免疫分析法必须使用放射性标记物，对操作人员存在放射性 危害，同时，由于其使用的放射性物质时刻都在衰变，试剂保存时间不长， 为临床应用带来诸多不便；而使用较广的酶免疫分析方法存在检测范围窄， 灵敏度低等缺点，也不能满足临床需求。化学发光免疫分析(Chemiluminescence Immunoassay, CLIA)是将化学发光 或生物发光体系与免疫反应相结合，用于检测微量抗原或抗体的一种新型标记免 疫测定技术。其检测原理与放射免疫和酶免疫相似，不同之处是以发光物质代替 放射性核素或酶联显色底物，并借助其自身的发光强度直接进行测定。生物素-亲和素系统(biotin-avidin system, BAS)是以生物素和亲和素具 有的独特结合特性为基础，它们均可与抗原抗体等大分子生物活性物质偶联，它 们的结合迅速、专一、稳定，可以增加参与反应的有活性的抗原或抗体数，与固相直接包被相比，提高了测定的灵敏度，节省了原料和成本，同时便于产业化生 产和控制。目前，化学发光免疫分析技术结合生物素一亲和素系统还未见应用于胰岛素 自身抗体免疫分析产品中。现有技术中的化学发光免疫分析试剂盒为封闭式全自 动化学发光测量系统，需要昂贵的全自动化学发光测量仪，从而限制了推广使用， 无法广泛地应用于临床诊断和科研工作。
技术实现思路
本专利技术很好地解决了上述问题，即将化学发光技术与生物素-亲和素系统有效 结合，应用于检测胰岛素自身抗体，并提供了一种能够简便、快速、灵敏、稳定 地检测胰岛素自身抗体的试剂盒。该试剂盒既具有放射免疫的高灵敏度，又具 有酶联免疫的操作简便、快速等特点，易于标准化操作，且测试中不使用有 放射性的试剂，试剂保存时间长，既可应用于开放式的半自动化学发光测量 仪，也可应用于全自动的测量系统，可实现大批量快速检测，使用成本低， 适于在产业上有效地推广应用。本专利技术的目的是提供一种化学发光免疫分析测定胰岛素自身抗体的试剂盒。 本专利技术的再一目的是提供一种制备上述试剂盒的方法。根据本专利技术的试剂盒包括1)胰岛素自身抗体阴性和阳性对照品；2)样 品稀释液；3)亲和素化的固相载体；4)生物素化的胰岛素抗原；5)碱性磷酸酶 标记的羊抗人IgG抗体；6)化学发光底物l,2-二氧乙烷类衍生物；以及7)浓縮洗涤液。根据本专利技术的试剂盒，其中，所述样品稀释液为灭活的小牛血清；所述固相 载体为微孔板、塑料珠、塑料管或磁性颗粒；所述1,2-二氧乙烷类衍生物为(金 刚烷)-l,2-二氧乙垸、3-(2' _螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3〃 -磷酰氧基) 苯基-1,2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。本专利技术提供了一种制备上述试剂盒的方法，包括以下步骤l)配制胰岛素自 身抗体阴性和阳性对照品；2)配制样品稀释液；3)固相载体包被亲和素；4)使 胰岛素抗原生物素化；5)用碱性磷酸酶标记羊抗人IgG抗体；6)配制化学发光 底物1,2-二氧乙烷类衍生物；7)配制浓缩洗涤液；8)分装上述阴、阳性对 照品、样品稀释液、生物素化抗原、酶标记抗体、化学发光底物和浓縮洗涤液； 以及9)组装为成品。根据本专利技术的方法，优选，所述固相载体包被亲和素的步骤3)包括以下 步骤用0.05M的碳酸盐缓冲液配制成所需浓度的亲和素包被液，并将包被 液负载于固相载体上；然后进行洗涤、BSA封闭、除湿干燥并用铝箔袋封装。在上述方法中，优选，所述样品稀释液为灭活的小牛血清；所述固相载 体为微孔板、塑料珠、塑料管或磁性颗粒；所述1， 2-二氧乙烷类衍生物为(金 刚垸)-1,2-二氧乙烷、3-(2'-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3〃 -磷酰氧基) 苯基-1,2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。本专利技术"胰岛素自身抗体化学发光免疫分析定性测定试剂盒"可以非常专 一地检测出样本中是否含有胰岛素自身抗体，从而为I型糖尿病的诊断提供重要 的临床依据。它具有简便、快速、灵敏、稳定等优点。该胰岛素自身抗体化学发 光免疫分析定性测定试剂盒的各项指标均优于酶免疫分析法的水平。并且，本 专利技术的检测系统为开放式操作，简便快速，不需要昂贵的全自动化学发光测量仪， 特别适合广大的中小医院推广使用，为临床诊断和科研工作提供了一种非常有价 值的检测手段。本专利技术的试剂盒应用的是酶催化发光底物，通过检测发光底物产生的光信号 代替酶免疫分析中的显色底物，同时又结合生物素-亲和素系统，因而具有与酶免 疫分析同等的特异性，而灵敏度大大提高，可为胰岛素自身抗体的诊断提供更为 特异、快速、可靠的依据。 具体实施例方式实施例1制备本专利技术的胰岛素自身抗体化学发光免疫分析定性测定试剂在本专利技术的研究过程中，本专利技术的专利技术人首先对所用的原材料进行了筛选试 验和质量鉴定，然后对包被方法进行了研究，选择出了最合适的包被缓冲液和封 闭液，找到了最佳的浓度条件，并且，制备出了具有较高活性的酶标记物以及相 应的化学发光底物液。一、 酶标抗体和生物素化抗原的制备1. 碱性磷酸酶标记抗体的制备用戊二醛法将羊抗人IgG抗体与碱性磷酸酶偶联，对PBS充分透析，加等体 积甘油，一2(TC以下保存。2. 生物素偶联胰岛素抗原的制备(1) 用常规方法将生物素(BNHS)溶于N，N—二甲基甲酰胺(DMF)配成lmg/mL;(2) 用0. lmol/L pH值为9.0的NaHC03将纯化的胰岛素抗原稀释为l 2mg/mL;(3) 按BNHS与抗体容积比为1: 8或重量比1: 7左右混合，室温搅拌下反 应2 4h;(4) 装入透析对0. 05mol/L pH值为7. 2的PBS， 4'C透析过夜，结合物加等 体积甘油，小量分装，一2(TC以下保存。二、 胰岛素自身抗体阴性和阳性对照品的制备阳性对照品将经确切方法确定的高滴度胰岛素自身抗体阳性人血清混合成 阳性血桨(Positive Pool,血浆份数大于5)， 56°C 1小时加温灭活后，使用新 生牛血清进行适当稀释，加入生物防腐剂和万分之一 (W/V)的食品红使之成为红 色，除菌过滤，2 8'C保存。阴性对照品将胰岛素自身抗体检测为阴性的人血清混合(血浆份数大于10)， 56°C l小时加温灭活后，除菌过滤，2 8'C保存。三、 酶标抗体浓度选定采用方阵法选择酶标抗体的工作浓度为1: 8000。四本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种胰岛素自身抗体化学发光免疫分析定性测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：１）胰岛素自身抗体阴性和阳性对照品；２）样品稀释液；３）亲和素化的固相载体；４）生物素化的胰岛素抗原；５）碱性磷酸酶标记的羊抗人ＩｇＧ抗体；６）化学发光底物１，２－二氧乙烷类衍生物；以及７）浓缩洗涤液。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：高将，应希堂，胡国茂，郑金来，唐宝军，张坤，
申请(专利权)人：北京科美东雅生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]