丙型肝炎病毒基因分型检测试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及检测丙型肝炎病毒基因型的试剂盒，特别是涉及使用核酸反向斑点杂交技术，制备一种丙型肝炎病毒基因型检测的试剂盒，用于快速准确地区分临床血液样品中丙型肝炎病毒基因型。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及检测丙型肝炎病毒基因型的试剂盒，特别是涉及使用核酸反向斑点杂交技术， 制备一种丙型肝炎病毒基因型检测的试剂盒，用于快速准确地区分临床血液样品中丙型肝炎 病毒基因型。
技术介绍
丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)是严重危害人类健康的肝炎病毒之一，是重要 的肝脏疾病致病因子。目前，全球有超过L7亿人感染HCV，其中每年有超过10万例HCV 患者发展为肝癌，进而出现消化道出血及腹水。根据WHO 2002年年报，在2001年，慢性肝 病引起1,400万例死亡，包括79.6万例由肝硬化引起、61.6万例由原发性肝癌引起。而在2001 年，因慢性肝病引起死亡的病例中就有20% (超过2.8万)是由HCV感染引起。目前已经有 大量病例可以证明在大多数国家由肝癌引起的死亡数量的增加是由于丙型肝炎感染造成。丙型肝炎病毒是一种正性单链RNA黄病毒，包括9,400左右个核苷酸。HCV基因组具有一 个单独的开放阅读框，编码一具有3,010个氨基酸的多聚蛋白体，翻译后被分为病毒复制和病 毒粒形成所必须的结构和非结构蛋白。HCV具有高度的变异性(其变异率高达1.4-1.9X1(T3/ 核苷酸/年)和本身具有负选择作用的特征，高突变是由于复制酶无校正功能；易误性 RDRP(error-prone RDRP, EP-RDRP)的存在以及正选择作用等原因。而其本身具有负选择作用 又表现为病毒基因组中各种基因结构及功能不同，有些区域高度保守。根据全世界不同地 区分离的HCV不同株的全部或部分基因组的系统进化分析，HCV至少可分为6型(HCV1—6 型)，各型又分许多亚型(如la、 lb、 2a、 2b等)。各型核酸序列之间相差31—34%，氨基酸 序列相差大约30%,而亚型序列之间相差约20—23% 。有几种HCV病毒株主要从东南亚被分 离出，被命名为HCV7， 8， 9， 10， ll型，除了HCV10a型(目前被列入HCV3型)，由于其系 统进化上的相似性，其余各型被列入HCV6型。目前对HCV基因分型方法主要有限制性长度多态性(RFLP)，型特异性引物PCR，型 特异性探针核酸杂交分析，直接测序等方法，但是这些方法大多存在操作繁琐，检测时间长， 价格昂贵，灵敏度低，特异性不高等缺点，不适合广大基层医院开展。因此本专利技术人结合已 知的PCR-斑点杂交方法，制备了一种短时间内检测丙型肝炎基因型的试剂盒。
技术实现思路
本专利技术涉及检测临床生物样品中丙型肝炎病毒基因型的试剂盒，特别是提供了一种利用核酸反向斑点杂交技术快速准确的区分临床血液样品中丙型肝炎病毒基因型的试剂盒。因此本专利技术的一个目的是提供一种用于检测临床生物样品中丙型肝炎病毒基因型的试剂 盒，该试剂盒包括(1)待检血清样品RNA的提取试剂(2)逆转录试剂；(3)聚合酶链式反应试剂；(4)杂交膜及反向斑点杂交反应试剂。其特征在于 丙型肝炎(HCV)病毒核酸(RNA)逆转录引物逆转录(RT)引物5'-GCTCATGGTGCACGGTCTACGAGACCT-3'(SEQIDNO:l)聚合酶链反应扩增体系中使用的上游和下游引物分别为PCR上游引物5 '-TCTAGCCATGGCGTTAGTATGAGTGT隱3 '(SEQ ID NO:2) PCR下游引物5 '-CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGT-3 '(SEQ ID NO:3)杂交反应中使用的寡核甘酸探针分别是探针IC: 5'-GCCGTAACCGTCACAATCCGT-3' (SEQIDNO:4) 探针PC1: 5'-ATTTGGGCGTGCCCCCGC-3' (SEQIDNO:5) 探针PC2: 5'- CGGAACCGGTGAGTACACC -3' (SEQ ID NO:6)探针l:5- CAATGCCTGGAGATTTGGGCG -3'(SEQ ID NO:7)探针lb-l:5'-CCGCGAGACTGCTAGCCG -3'(SEQ ID NO:8)探针lb-2:5'-GCGAGACCGCTAGCCGAGT -3'(SEQIDNO:9)探针2-l:5'-AGTAGCGTTGGGTTGCGAAAG ■-3' (SEQIDNO:IO)探针2-2:5'-GTCCTTTCTTGGATAAACCCAC-3' (SEQIDNO:ll)探针2a-l::5'-GCCGGGAAGACTGGGTCCT -3'(SEQIDNO:12)探针2a-2:-CCCACTCTATGCCCGGCCA-3'(SEQ IDNO:13)探针3-l:5'-CCCGCGAGATCACTAGCCG -3'(SEQ ID NO: 14)探针3-2:5'-AATCGCTGGGGTGACCGGG -3'(SEQ ID NO:15)探针3b:5，-CCCGCTCAATGCCCGGAAAT -3，(SEQ ID NO:16)探针6:5，- GACCGGGTCCTTTCCATTGG -3'(SEQ ID NO: 17)根据本专利技术的一个实施优选方案，所设计的引物和探针是针对国际基因库Genebank中 已经发表的HCV (1-6)，选取高度保守的5'UTR区设计引物和探针。根据本专利技术的一个实施优选方案，针对1型的探针与已知的丙肝病毒2， 3， 4， 5， 6型 相应基因组序列差异不少于两个碱基。根据本专利技术的一个优选实施方案，其中所说的待检血清样品RNA的提取试剂包括RNA提取液A， RNA提取液B,DEPC水。根据本专利技术的一个优选实施方案，其中所说的逆转录(rt)试剂包括逆转录酶、逆转录 反应体系、阳性标准品、阴性质控品。根据本专利技术的一个优选实施方案，其中所说的聚合酶链反应试剂是由dNTPs、耐热Taq酶 等组成的PCR反应混合液。根据本专利技术的一个优选实施方案，其中所说的杂交反应试剂包括杂交液i u.8xssc-o.i%sds)禾nn (o.5xssc-o.i%sds)、溶液i (250u/mi偶联辣根过氧化物酶的链酶亲和素溶液)、II (0.1mol/L的柠檬酸钠溶液)、III (2mg/ml的四甲基联苯胺溶液)和IV (3%的 过氧化氢溶液)、杂交用膜条以及标准对照品。根据本专利技术的一个优选实施方案，所说的检测是使用带有多孔滤板和减压抽吸部件的反 向点印迹杂交装置、恒温水浴或空气浴装置完成的。根据本专利技术的一个优选实施方案，其中所说的标记引物的小分子可以是生物素，地高辛 等。 '根据本专利技术的一个优选实施方案，其中所说的基质可以是尼龙膜、硝酸纤维素膜醋酸纤 维素膜。根据本专利技术的一个优选实施方案，其中所说的将探针固定在膜条适当为位置的方法，包 括将探针通过紫外线交联，以及用氨基标记的探针交联EDC (N-乙基-N'--碳 二亚胺，Sigma公司)处理过的硝酸纤维素、尼龙或醋酸纤维素等固相支持材料。传统的印迹杂交方法是将靶DNA固定于尼龙膜或硝酸纤维素膜上，用标记的探针与待 检靶DNA相互接触并杂交，显影或显色后判定结果。用这种方法每次杂交反应只能检测一 个待测DNA中是否含有某一种探针的互补序列，即一次只能判断一种基因型。如果某个基 因座位有多种等位基因(如HLA-A， HLA-B， HLA-DR位点)或要检测多本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测丙型肝炎病毒基因型的试剂盒，该试剂盒包括：（１）ＲＮＡ提取试剂；（２）逆转录试剂；（３）聚合酶链式反应试剂；（４）杂交膜及反向斑点杂交反应试剂，其特征在于试剂盒所应用的引物分别为：　逆转录（ＲＴ）引物：５′－ＧＣＴＣＡＴＧＧＴＧＣＡＣＧＧＴＣＴＡＣＧＡＧＡＣＣＴ－３′（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１）　ＰＣＲ上游引物：５′－ＴＣＴＡＧＣＣＡＴＧＧＣＧＴＴＡＧＴＡＴＧＡＧＴＧＴ－３′（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２）　ＰＣＲ下游引物：５′－ＣＡＣＴＣＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡＧＧＣＡＧＴ－３′（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３）。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王敏，王会龙，马丽，李明，程钢，何蕴韶，
申请(专利权)人：中山大学达安基因股份有限公司，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]