用于检测生物样品中氧化应激生物标志物的方法技术

本发明专利技术涉及用于检测生物样品中氧化应激的方法，确定氧化损伤累积记录的方法，以及根据生物标志物或其组分的存在或不存在来诊断衰老疾病如心血管疾病的方法。本发明专利技术还涉及用于检测生物样品中氧化应激的试剂盒，该试剂盒包括稳定化试剂和抗体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于检测生物样品中氧化应激的方法，确定氧化损伤累积 记录的方法，以及根据生物标志物或其组分的存在或不存在来诊断衰老疾 病例如心血管疾病的方法。本专利技术还涉及用于^r测生物样品中的氧化应激 的试剂盒，其包括稳定化试剂和抗体。
技术介绍
在过去的30年中，积累了支持氧化应激与衰老和心血管疾病(CVD) 发病有关联的大量实验证据。众所周知，"自然抗氧化剂"的随机临 床试验令人失望(HOPE, HPS, GISSI-prevention)，并使一些人对氧化应激 假说的关联性提出疑问。然而，这些研究的大部分没有评价抗氧化剂 干预对氧化应激状态的影响，也没有使用备受争议的硫代巴比妥酸反应物 质方法(TBARS) 。这可以通过评估人类研究得到的液体中氧化应激生 物标志物的验证方法所遇到的困难，得到部分解释，这些方法通常需要昂 贵的和复杂的质谱技术。最近，异构前列腺素快速成为了相对好的体内氧 化应激_诱导的脂质过氧化作用标志物。然而，单一生物标志物的测 定几乎不能提供各种与氧化应激有关的可能对CVD进程有利事件的综合 描述。在过去的10年中， 一个氧化应激-相关的分子4-羟基-2， 3-壬烯醛 (HNE)成为了值得考虑的研究兴趣。 HNE是一个醛终产物，它由最 大类别的n-6多聚不饱和脂肪酸过氧化产生。近似于自由基，醛类是易 与蛋白质氩基酸和脂类的亲核残基反应的亲电子试剂，但是它们相对更长 的半衰期使得他们是延长对相邻细胞损伤的候选物。在这些醛类中，像HNE这样的4-羟基-2-烯醛，因为它们的a,p-双键而被认为是最有效的反应 物类。对HNE的兴趣不仅来自于它作为氧化应激-诱导脂质过氧化作用 (LPO)生物标志物的潜在用途，还因为有积累的证据表明HNE可以调 节在细胞增殖、细胞凋亡和炎症中涉及的信号传导途径，这是CVD的标 志。然而，对HNE作为在CVD中的氧化应激-相关事件的活性生物 标志物的作用还有很多有待研究。因HNE通过还原成1， 4-二羟基壬烯 (DHN)、氧化成4-羟基壬烯酸或结合谷胱甘肽而快速细胞代谢，最近 的研究对测量HNE代谢物，如尿或血浆中二羟基壬烯硫醚氨酸， 而不是游离HNE的潜在用途给予重视。HNE-蛋白质加合物也被确认。有报道指出，在心月几组织中氧化应激的 条件下，在循环清蛋白和氧化脂蛋白中，由免疫和气相色谱 -质谱(GCMS)法测出这些加合物水平上升了。然而，以前没有检验过循 环HNE-蛋白质加合物可以反映出加强的系统或组织特异性氧化应激的可 能性，并且这些加合物在全血、血浆或其它血衍生物样品中的定量方法， 以前也没有祐:描述过。因此，虽然衰老造成的许多退化型疾病，包括心血管疾病，涉及氧化 应激作用，但是仍需要在这些疾病中，特别是在人类中，鉴定氧化应激-相关事件的生物标志物，例如脂类过氧化反应产物4-羟基-2， 3-壬烯醛 (HNE)和其蛋白质硫醚加合物。综上所述，产业需要提供通过使用适当 生物标志物来检测和定量生物样品中氧化应激的新方法。
技术实现思路
第一个大的方面，本专利技术涉及一种使用包含氧化应激生物标志物的生 物样品检测氧化应激的方法。该方法包括获得生物样品，在化学上稳定 氧化应激生物标志物，以生产稳定的氧化应激生物标志物；并在使氧化应 激生物标志物稳定后，评估样品中祐L稳定的氧化应激生物标志物的存在。有利地，该方法允许在评估生物标志物的存在时进行相对复杂和漫长的过程，同时保证样品中生物标志物水平在这一过程中保持大体上恒定。并且，这种方法相对容易使用标准实验室程序来进行。在本专利技术的一些实施方案中，这种方法可以使用试剂盒来进行，这样 就允许在相对少数的、相对筒单的操作步骤下，相对有效和筒单地进行该 方法。为了更清楚，出于本文件的目的，术语氧化应激生物标志物包括氧化 应激本身的生物标志物和氧化应激-相关事件的生物标志物，例如但不仅限于在衰老和心血管疾病的发生和发展中涉及的氧化应激诱导的LPO事件 的生物标志物。在本专利技术的一些实施方案中，氧化应激生物标志物选自醛-蛋白质加合 物和醛代谢物-蛋白质加合物。例如，代谢物-蛋白质加合物是代谢物-蛋白 质硫醚加合物。在其他的例子中，代谢物共价结合在任何适合的氨基酸上， 如组氨酸或赖氨酸等，或任何其它适合的物质。在本专利技术的具体实施方案中，醛包括4-羟基-2， 3-壬烯醛(HNE)， 1， 4-二羟基壬烯(DHN)。在这两种情况中，在本专利技术的一些实施方案中， 可测组分可选自DHN和fH]DHN。在其它实施方案中，氧化应激生物标 志物的可测组分是另一个通过脂肪酸过氧化产生的代谢物，例如但不仅限 于4-鞋基壬烯醛、4-氧基壬烯醛、4-鞋基己烯醛和4-氧基己烯醛。在一些实施方案中，可测組分的量使用与质镨偶联的气相色谱测量。在本专利技术一些实施方案中，化学稳定样品中的生物标志物包括还原 醛至其醇，例如，通过向生物样品中加入NaB2114或NaBH4 。在这些实施 方案的变化形式中，还原醛至其醇包括还原HNE为DHN和/或还原HNE 为其氘代醇fH]DHN。在本专利技术一些实施方案中，生物样品包含选自HNE、 HNE-蛋白质加 合物、DHN、 DHN-蛋白质加合物、HNE的代谢物及其组合的分子。在本专利技术一些实施方案中，分离可测组分包括裂解蛋白质键。例如， 裂解蛋白质键的步骤包括使用阮内镍催化裂解蛋白质硫醚键。在一个具体 的例子中，阮内镍催化在约45。C至约60。C的温度下进行约5小时至约20小时。在本专利技术一些实施方案中，生物样品选自全血、血衍生物及其组合， 血衍生物选自例如血浆、清蛋白和氧化脂蛋白等。第二个大的方面，本专利技术涉及使用生物样品检测氧化应激的方法，该方法包括获得含有氧化应激生物标志物的生物样品；化学稳定样品中的 生物标志物；使样品与结合稳定的生物标志物的抗体接触；和检测样品中 结合抗体的存在。第三个大的方面，本专利技术涉及用于确定哺乳动物中氧化损伤随时间的 累积记录的方法，该方法包括在第一时间点从哺乳动物获得第一血液样 品，其中血液样品包含醛代谢物-蛋白质加合物；根据醛代谢物的量检测在 第一血液样品中氧化应激的水平；在第二时间点从哺乳动物中获得第二血 液样品，其中血液样品包含醛代谢物-蛋白质硫醚加合物；根据醛代谢物的 量检测第二血液样品中氧化应激的水平；和用在第一和第二血液样品中测 量的酪代谢物的量确定在此哺乳动物中氧化损伤的累积记录。第四个大的方面，本专利技术涉及用于评估哺乳动物患心血管疾病风险的 方法，包括从哺乳动物中获得包含HNE-蛋白质加合物和DHN-蛋白质加 合物的生物样品；测量样品中HNE-蛋白质加合物和DHN-蛋白质加合物的 量；确定HNE-蛋白质加合物和DHN-蛋白质加合物之间的预定关系；根据 所迷预定关系评估哺乳动物患心血管疾病的风险。第五个大的方面，本专利技术涉及用于诊断哺乳动物例如人类心血管疾病 或其风险的方法，包括从哺乳动物获得包含醛代谢物-蛋白质加合物的生 物样品；测量样品中醛代谢物-蛋白质加合物的量；以及如果生物样品中存 在的醛代谢物-蛋白质硫醚加合物的量高于预定阈值，则诊断此哺乳动物为 有心血管疾病或其风险。例如，心血管疾病或其风险因素选自高血压、胰 岛素抵抗、高血糖、高血脂、舒张功能障碍、心肌纤维化和心律不齐、心 脏肥大本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种使用生物样品检测氧化应激的方法，该方法包括：　（ａ）获得包含氧化应激生物标志物的生物样品，所述生物标志物含有可测组分；　（ｂ）化学上稳定所述样品中的所述生物标志物；　（ｃ）分离所述可测组分；　（ｄ）提取所述可测组分；和　（ｅ）测量所述可测组分的量。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：克里斯廷迪斯罗西尔斯，卡罗琳阿斯兰，伯特兰布查德，吉恩克劳德塔迪芙，布兰丁孔德，
申请(专利权)人：蒙特利尔心脏病学研究所，
类型：发明
国别省市：CA[加拿大]