发光的转基因非人动物、其后代、细胞衍生物及其应用制造技术

本发明专利技术描述一种能在体内合成和表达脱光蛋白（ａｐｏｐｈｏｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）的非人转基因动物、其后代、细胞衍生物及其应用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】发光的转基因非人动物、其后代、细胞衍生物及其应用本专利技术涉及能在体内合成和表达脱光蛋白(apophotoprotein)的 转基因非人动物及其应用。
技术介绍
干细胞是能长期通过细胞分裂进行自身更新的非特化的细胞(1)。 此外，在某些生理或实验条件下，它们可以分化成不同的细胞类型， 比如搏动的心肌细胞(beating cardiomyocytes )或胰腺的胰島素生 产细胞(2 、 3)。干细胞可以根据它们的潜力进行细分和分类。全能性干细胞由卵 和精细胞的融合产生。由受精卵细胞的前几次分裂产生的细胞也是全 能性的。这些细胞可以分化为任何类型的细胞。多潜能干细胞是全能 细胞的后代，可以分化成任何细胞类型，全能性干细胞除外。多能干 细胞仅能产生与之紧密相关的细胞家族(举例来说，血细胞，例如红 细胞、白细胞和血小板)。祖(有时称为单能)细胞只能产生一种细 胞类型，但其自我更新能力的特性将它们与非干细胞(3-6 )区别。干细胞还可以按照它们的来源分类，来源于成体或胚胎，成年千 细胞是在一种特殊组织的已分化细胞中发现的未分化细胞，多为多能 干细胞，能产生几种但有限数目的细胞类型，它们还包含得自嬰儿、 脐带、胎盘和羊水的干细胞。它们也被称为成体干细胞，或组织干细 胞，存在于已分化组织中，在可控方式下，它们分化和/或分裂产生其 起源的组织的所有特化细胞类型(7-9)。胚胎干细胞具有形成各种特化细胞包括生殖细胞(多能性)的潜 能。它们在允许增殖而不分化的条件培养下(3)，具有无限增殖的能 力。迄今从啮齿动物和人中已发现三种多能胚胎干细胞(10):衍生自植入前胚泡期胚胎的内细胞团的胚胎干细胞(ES)。它们 具有正常的核型。已知并且建立了一些老鼠和人胚胎干细胞类型，例如老鼠ES TBV2、 Rl、 D3细胞(11-13、 63)。衍生自畸胎癌的胚胎癌细胞(EC)。畸胎癌是性腺瘤，含存在于 来源于三个原胚层(内、中和外胚层)的多种组织的多能干细胞。最 常用的是小鼠EC P19细胞系。这些细胞不具备正常核型(14-18)。-衍生自胎儿生殖嵴(PGCs )的培养的原生殖细胞的胚胎生殖细胞 (EG)。它们具有正常核型但是遗传印记异常(l9-22)。ES和EG细胞可以注入受体小鼠的胚泡，产生嵌合动物。在嵌合 小鼠中这些多潜能细胞可以成为各种细胞类型，包括种系细胞(20， 21， 23， 24)。相反，将鼠科EC细胞引入胚胎能移植产生大部分胚胎 镨系，但通常不能移植产生种系细胞，有一个实验例外(25-27 ) 。 EC 细胞无法形成有功能的配子，很可能反映出它们的异常核型(28)。干细胞是高通量筛选(HTS)技术中一种很有效的工具，因为它们可 以在体外长期培养和扩增，保持自我更新的性质，并且能够进行微型 化。它们允许通过利用可筛选和可诱导标记来制备纯的ES细胞群。基 因靶向/同源重组技术允许敲除(K0)或敲入(KI)特殊的基因。此外胚胎 千细胞可以分化变成类似初级细胞的任何细胞类型，(因为它们是非 肿瘤细胞)。这样它们为靶标提供一种自然环境，它们可以呈递自然 调控和表达的复合目标(像多亚基离子通道)。这是一个重大的改善， 因为通常在HTS筛选中，基于细胞的试验利用肺瘤细胞系建立，而已 知这种肿瘤环境可以改变细胞的生理条件。在药学领域，利用多潜能胚胎干细胞已获得基础的作用(29)。 例如用于靶标估值，因为成功的药物发现的基础在于了解基因功能， 相对于K0小鼠，鼠科ES细胞是一种更快速和便宜的工具。另外万一 出现致死的K0，利用ES细胞可以有助于基因功能评价。干细胞也用于胚胎干细胞测试(EST),它由EVCAM (欧洲替代动 物实验方法研究中心)研究进行正面评价。它是针对药物对从3个种 系(内、中和外胚层)产生的细胞和组织分化的毒理学和畸形学试验。 在分析关于由多潜能干细胞分化产生的脉动心肌细胞的变时性活性的 药物副效应时，干细胞也很重要。这类试验可以减少用于毒物学研究的动物数目。例如当前在欧盟销售的多达30000种化学药品在接下来 的IO年里需要重新评价。这意味着利用约一千万只动物。在这种意义 上讲，创建像EST那样的体外试验是至关重要的，它也能允许测试更 多的化学药品，比传统的整体动物试验花费时间更少(30， 31, 32)。 生物发光是活体生物或源自其的物质通过各种的化学发光反应体 系发射可见光的一种现象。生物发光反应需要三个主要部分萤光素 (底物)，荧光素酶(酶)和分子氧。然而， 一些反应也可能需要其 他成分，包括阳离子(Ca"和Mg++)和辅因子(ATP， NAD(P)H)。荧光 素酶是能催化底物萤光素氧化，产生不稳定中间体的酶。当不稳定的 中间体衰退到基态时，产生氧化萤光素，发出光。存在许多不同的没 有关联的萤光素类型，虽然来自至少七个门的很多物种使用相同的萤 光素，称为腔肠素(coelenterazine)。在一些动物(例如水母)中， 萤光素/荧光素酶体系能以稳定的"发光蛋白"形式提取，它结合钾而发 光。发光蛋白区别于荧光素酶的地方在于它们是荧光素酶和费光素的 稳定氧化中间体复合物。发光蛋白存在于许多海洋腔肠动物中，并允许这些生物因为种种 原因包括繁殖、进食和防卫而发光(33)。存在许多发光的生物，但 是只有七种发光蛋白，即thalassicolin ( 34, 35 )、水母发光蛋白 aequorin( 36, 37， 38 )、 mitrocomin( halistaurin的类似物)(39, 40 )、 clytin(phialidin的类似物)(40, 41)、螅蛋白(34, 38,42, 43 )、 mnemiopsin ( 44, 45 )和瓜水母光蛋白berovin ( 44, 45 )迄今已被分 离。所有这些蛋白质都是由脱辅基蛋白，咪唑并哌唤发色团(即，腔 肠素)和氧形成的复合体。它们的氨基酸序列高度保守，特别是在包 含三个钙结合位点(EF手结构)的区域。术语"发光蛋白"指能发光 的腔肠素结合的多肽，而"脱光蛋白"用来表示没有腔肠素的发光蛋 白。研究最多的发光蛋白是分离自水母(Aequorea victoria )的水母 发光蛋白(46),以及分离自长薮枝螅水母(Obelia longissima)的 螅蛋白(47)。通过与腔肠素，分子氧，EDTA和2-巯基乙醇或二硫苏糖醇温育，发光蛋白可从脱光蛋白中再生。由于腔肠素是发光蛋白水母发光蛋白，mitrocomin， clytin和螅蛋白共同使用的发光底物， 这四种发光蛋白的发光反应很可能是一样的(48， 49， 50， 51)。研究细胞事件和它们的调控需要灵敏的非侵入的分析方法。发光 蛋白和通常使用的生物发光是极好的报告体系，因为它们与荧光系统 相比，几乎没有背景。发光蛋白作为报告基因广泛的用在细胞培养体系中，以监视与信 号转导和基因表达相关的细胞事件(33,34,46 )。发光蛋白在哺乳动 物细胞中表达，以监视对不同刺激应答的钙变化。通过添加辅因子腔 肠素到表达脱光蛋白的哺乳动物细胞中并探测指示胞内钓浓度的光子 发射，测定胞内钓浓度。通过利用表达与胞内钾浓度相关的脱光蛋白 和受体的细胞，为筛选影响胞内钾释放的化合物提供有效体系。高通量筛选试验经常被本文档来自技高网...

【技术保护点】
非人转基因动物、其后代和细胞衍生物，所述的非人转基因动物、其后代和细胞衍生物能表达脱光蛋白基因，并产生应答胞内钙浓度变化的生物发光信号。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：S卡伊纳卡，C努奇，S科拉扎，S洛默尔，
申请(专利权)人：AXXAM股份公司，
类型：发明
国别省市：IT[意大利]