抗体依赖性细胞毒性检测制造技术

本发明专利技术涉及用于检测抗体依赖性细胞毒性（ＡＤＣＣ）的方法，该方法不需要标记，并可以实时地对粘附的细胞进行。该方法包括例如，（ａ）监测支持靶细胞在检测培养基中生长的非导电基质上的电极之间的阻抗；和（ｂ）向检测培养基中加入效应的细胞和结合靶细胞的一种抗体；其中加入效应细胞和抗体后，基质上的电极之间的阻抗下降表明在检测培养基中ＡＤＣＣ功能已经生效。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本申请涉及用于检测抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的方法和(在一 些实施方案中)涉及不需要标记细胞的以实时方式对ADCC进行检测的 方法。
技术介绍
ADCC是免疫应答組成部分，其中IgG抗体结合到病原或致瘤靶细 胞表面的抗原上，标识它们并通过NK效应细胞进行破坏。具有Fey 受体(FcyR)的效应细胞识别结合到靶细胞的抗体的Fc区域并与之 结合。因此抗体给予了由效应细胞介导的靶细胞杀伤特异性，在两种 细胞类型之间形成一个桥梁并随后释放裂解颗粒。一些治疗性抗体通过增强ADCC来发挥其生物活性。例如， 一种用 于治疗乳腺癌的人源化抗体Herc印tii^能通过结合癌细胞表面上的 HER-2抗原来增强ADCC。同样， 一种用于治疗非何杰金淋巴瘤 (non-Hodgkin's lymphoma)的嵌合抗体Rituxan。通过结合淋巴瘤细 胞表面上的CD20抗原来增强ADCC。测定抗体是否诱导ADCC的技术通常涉及用放射性物质(例如Cr51) 或荧光染料(例如Calcein AM)标记靶细胞。被标记的细胞与抗体和 效应细胞(例如NK细胞或PBMC)孵育，并通过放射性或荧光的释放 检测通过ADCC进行的乾细胞杀伤。在这种检测中乾细胞的标记需要使 贴壁细胞脱离来进行标记。标记后，用悬浮状态的靶细胞进行检测，这对于贴壁细胞不是一种正常状态。此外，通常只在将靶细胞与效应细胞和抗体混合数小时后的一个时间点里测定ADCC介导的细胞杀伤 的程度。已经开发出一种无标记检测，其中通过测定从裂解细胞的细 胞质释放到无细胞上清液中的乳酸脱氩酶(LDH)来检测细胞杀伤。但 是，LDH法不是一种实时的检测，并且它不能将乾细胞的死亡和效应 细胞的死亡区分开，因为两种类型的细胞在溶胞中都将释放LDH。考虑到目前正在销售的或正在开发中的治疗性抗体产品的数量， 存在着对能测定抗体ADCC活性的体外检测方法的需求。尤其是，需要 一种高通量的、无标记的ADCC检测来实时监测ADCC，并且不需要让 贴壁细胞脱离。
技术实现思路
本申请提供了体外检测ADCC的方法。方法是无标记的或需要较低 水平标记的，因此和需要标记细胞的检测相比更容易操作并且更安全。 在一些实施方案中，该方法还在贴壁细胞中进行，而不是在悬浮细胞 中进行。此外，该方法可以以实时方式进行，能够追踪ADCC反应的动 力学，因此能够比较不同抗体的ADCC动力学。并且和标准ADCC检测 相比此处提供的方法灵敏度更高，能够检测不同抗体ADCC动力学的较 小的差别。此外，在一些实施方案中，此处所提供的方法的简单性意 味着比标准ADCC检测更快速，并且具有为高通量筛选ADCC活性进行 优化的潜力。此处提供的方法包括(a)监测支持靶细胞在检测培养基中生长的 非导电基质上的电极之间的阻抗；和(b)向检测培养基中加入效应细胞 和结合乾细胞的一种抗体。加入效应细胞和抗体后，基质上的电极之 间的阻抗下降表明在检测培养基中ADCC功能已经生效。加入效应细胞 和抗体后，基质上的电极之间的阻抗增高或未改变，能够表明在检测 培养基中未发挥ADCC功能。一方面，本申请描迷了 一种检测抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的方 法，包括(a)监测支持靶细胞在检测培养基中生长的非导电基质上的电极之间的阻抗；和(b)向检测培养基中加入效应细胞和结合乾细胞 的一种抗体；其中加入效应细胞和抗体后，基质上的电极之间的阻抗 下降，表明在检测培养基中ADCC功能已经生效，而在加入效应细胞和 抗体后，基质上的电极之间的阻抗增高或未改变，能够表明在检测培 养基中未发挥ADCC功能。该方法包括在规则周期中检测阻抗。包括从 每次阻抗测量中导出细胞指数(CI)并确定细胞指数是否发生变化， 其中使用下面的公式从每次阻抗测量中导出细胞指数，其中Rb (f)和R ^胞(f)分别是在细胞存在或不存在情况下的频率依 赖性电极电阻，N是阻抗检测处的频点(frequency points)数。可 以使用RT-CES頃系统进行该方法。可以每15分钟检测一次阻抗。该方法可以进一步铺板靶细胞。在靶细胞铺板18到24小时之后 加入抗体和效应细胞。靶细胞在基质上可以是单层。能以每孔2K到 100K的密度铺板耙细胞(例如，每孔15K到25K之间，或大约每孔20K )。 效应细胞对靶细胞的比例(E:T)可以是25:1。 E:T可以超过10:1、超 过50:1、或超过100:1。可以以大约1和大约100 |Lig/ml之间、大约1和大约50 |Lig/ml 之间、或在大约2和大约8 Mg/ml之间的浓度加入抗体。可以包括向 检测培养基中加入结合靶细胞的2种或2种以上的抗体，结合靶细胞 的3种或3种以上的抗体，或者结合靶细胞的的4种或4种以上的抗 体。抗体可以来自于自身免疫性疾病患者.靶细胞可以表达顶端抗原。该方法可以包括才艮据顶端抗原表达筛 选把细胞的预先步骤。靶细胞可以是癌细胞或病毒感染的细胞。癌细 胞可以来自于一种细胞系，癌细胞可以是SKBR3细胞或MG63细胞。效应细胞可以包括外周血单核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、 单核细胞、细胞毒T淋巴细胞或中性粒细胞。30.方法的步骤(b)可以 包括向粑细胞中加入已经部分富集效应细胞的全血。方法的步骤(b) 可以包括向效应细胞中加入全血，其中所述全血包含效应细胞。在另 一方面，本申请描述了 一种根据诱导针对靶细胞的ADCC的能力筛选候选抗体的方法，包括(a)监测支持靼细胞在检测培养基中 生长的非导电基质上的电极之间的阻抗；和(b)向检测培养基中加入效 应细胞和结合靶细胞的候选抗体；其中加入效应细胞和抗体后，基质 上的电极之间的阻抗下降，表明了候选抗体具有影响针对乾细胞的 ADCC功能的能力，而在加入效应细胞和抗体后，基质上的电极之间的 阻抗增高或未改变，表明了候选抗体不具有影响针对乾细胞的ADCC 功能的能力。在另一方面，本申请描述了一种鉴定适合接受候选抗体治疗的、 患有和靶细胞相关疾病的病人的方法，该方法包括(a)监测支持和 疾病相关的靶细胞在检测培养基中生长的非导电基质上的电极之间的 阻抗；和(b)向把细胞中加入分离自患者的PBMC和候选抗体；和(c) 测定在加入PBMC和抗体后，基质上的电极之间的阻抗是否存在变化， 其中基质上的电极之间的阻抗下降，表明病人适合接受该抗体治疗， 而在加入PBMC和抗体后，基质上的电极之间的阻抗增加或没有变化， 表明病人缺乏接受该抗体治疗的适合性。在另 一个方面，本申请描述了 一种根据调节ADCC的能力筛选候选 化合物的方法，包括(a)监测支持靶细胞在检测培养基中生长的非 导电基质上的电极之间的阻抗；和(b)在存在或不存在候选化合物的情 况下，向检测培养基中加入效应细胞和一种抗体，其中所述抗体和靶 细胞结合；和(c)比较存在候选化合物时加入效应细胞和抗体后基质上胞和抗体后基质上的电极之i':i的阻抗出、现的任何变化，其中存在^选化合物时阻抗的变化大于不存在候选化合物时阻抗的任何变化，表明 该候选化合物具有调节ADCC的能力。筛选的化合物能够调节自身免疫 相关的ADCC。本申请还描述了如此处所述的一种高通量检测方法，其中非导电 基质包含两个或多个微量滴定孔(well)，每个孔包含至少本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测抗体依赖性细胞毒性（ＡＤＣＣ）的方法，包括：　（ａ）监测支持靶细胞在检测培养基中生长的非导电基质上的电极之间的阻抗；和　（ｂ）向检测培养基中加入效应细胞和结合靶细胞的一种抗体；　其中加入效应细胞和抗体后，基质上的电极之间的阻抗下降，表明在检测培养基中ＡＤＣＣ功能已经生效；其中加入效应细胞和抗体后，基质上的电极之间的阻抗增高或未改变，能够表明在检测培养基中未发挥ＡＤＣＣ功能。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：J库尼奇，刘诚，
申请(专利权)人：诺华公司，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]