一种多功能改性壳聚糖自愈合水凝胶的制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种多功能改性壳聚糖自愈合水凝胶的制备方法及应用。经本发明专利技术制备方法得到的自愈合水凝胶为实现不同生长因子在不同时间阶段的功能，引入微球作为后释放药(TGFβ3)的包封剂与直接负载在凝胶内的bFGF相隔离，形成一个内室的结构，达到序贯释放不同生长因子的目的。本发明专利技术制备的水凝胶具有良好的理化性能，以及良好的可注射性能，可以用于骨损伤修复的原位注射，通过序贯释放不同生长因子来修复损伤的骨组织，为骨组织工程领域的基础研究提供一种新的解决方案和修复手段。

【技术实现步骤摘要】
一种多功能改性壳聚糖自愈合水凝胶的制备方法及应用
本专利技术属于组织工程和再生医学领域，具体涉及一种多功能改性壳聚糖自愈合水凝胶的制备方法及应用，特别是可用于骨缺损的修复治疗。
技术介绍
骨缺损是指由于创伤、感染、肿瘤、先天性疾病等造成的骨结构完整性被破坏的疾病，是临床上常见的症状。通常，严重的骨缺损无法自行愈合和修复，必须借助骨修复材料才能得到有效的恢复。据统计，在全球范围内，每一年需要进行骨移植手术的患者超过2200万，手术费用超25亿美元；而在中国每年因骨缺损或骨折所需要进行移植手术的患者数量可达到300万以上。干细胞是骨缺损治疗和修复的种子，起到生成骨的作用。然而移植的干细胞通常在损伤部位的微环境下难以定向诱导分化进行主动修复。因此，联合外源的生长因子作为干细胞分化的指导者，促进种子干细胞对骨损伤进行修复格外重要。目前研究较多的生物支架材料有壳聚糖、胶原和丝素蛋白等。其中，壳聚糖是一种带正电的天然碱性多糖，由于其具备优良的生物相容性，生物降解性，无免疫原性以及抗细菌和真菌的特性，而被广泛应用于组织工程当中。天然的生物衍生材料可制备成多种形式应用于骨缺损修复中。例如凝胶、微球、海绵、薄膜和静电纺丝等。其中，水凝胶具有与天然ECM最为相似的结构。可注射水凝胶可以直接注射到患处无需手术过程，最大限度减少了手术创伤，提高了患者的舒适度；其次，水凝胶可以适应各种损伤环境，随着伤口形状大小的改变而改变，避免了因不规则形状造成的机体损伤；再者，载药水凝胶持续缓慢释放药物不仅降低了给药次数和药物副作用，同时提高治疗靶向性。但是，传统的水凝胶遇到了一些应用的挑战，如注入后的机械力的变化会导致支架变形甚至破坏，赋予水凝胶自愈能力可保持其结构和功能完整性。
技术实现思路
针对现有技术上存在的不足，本专利技术的首要目的是提供一种多功能改性壳聚糖自愈合水凝胶。本专利技术的第二个目的是提供上述多功能改性壳聚糖自愈合水凝胶的制备方法。本专利技术的第三个目的是提供上述多功能改性壳聚糖自愈合水凝胶的用途。因此，本专利技术提供以下各项：1.一种多功能改性壳聚糖自愈合水凝胶的制备方法，包括以下步骤：1)以壳聚糖为原料，采用乳化交联法制备壳聚糖微球；2)制备壳聚糖微球的溶液，在所述壳聚糖微球的溶液中加入TGFβ3，形成含有TGFβ3的壳聚糖微球；3)以壳聚糖谷氨酸盐(CSG)和四臂聚乙二醇苯甲醛(PEG-BA)为原料，采用Schiff碱反应，制备自愈合水凝胶；和4)将步骤3)中制备的自愈合水凝胶与bFGF混合，再与步骤2)中制备的含有TGFβ3的壳聚糖微球混合，得到多功能改性壳聚糖自愈合水凝胶。2.根据以上1所述的方法，其中在步骤1)中，将壳聚糖水溶液作为水相，将石油醚、液体石蜡、Span80、或它们的混合物作为油相，在搅拌下将所述水相加入所述油相，加入戊二醛交联，获得壳聚糖微球。3.根据以上1所述的方法，其中在步骤2)中，所述壳聚糖微球含有包括TGFβ3或其他活性因子中的一种或几种的组合。4.根据以上1所述的方法，其中在步骤3)中，所述自愈合水凝胶的制备方法如下：称取壳聚糖谷氨酸盐(CSG)粉末，于pH为7.4的PBS溶液中搅拌使其完全溶解，然后将其转移至含pH为7.4的PBS溶液的透析袋中透析至获得的壳聚糖谷氨酸盐溶液pH至6.8，室温保存备用；同时，称取四臂聚乙二醇苯甲醛(PEG-BA)粉末在超纯水中溶解完全，-20℃下保存备用；最后将配置好的壳聚糖谷氨酸盐(CSG)溶液和四臂聚乙二醇苯甲醛(PEG-BA)溶液混合，得到自愈合水凝胶。5.根据以上4所述的方法，其中所述壳聚糖谷氨酸盐(CSG)溶液与四臂聚乙二醇苯甲醛(PEG-BA)溶液的体积比为1：0.01-1：1(例如，1:0.025、1:0.05和1:0.1)，壳聚糖谷氨酸盐溶液的质量体积浓度为5-50％，PEG-BA溶液的质量体积浓度为1-30％。6.根据以上1所述的方法，其中在步骤4)中，所述自愈合水凝胶包括bFGF或其他活性因子(例如血小板衍化生长因子(PDGF))中的一种或几种的组合。7.根据以上1所述的方法，其中在水凝胶中壳聚糖微球的浓度为0.1-10mg/mL(诸如0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0mg/mL)。8.一种多功能改性壳聚糖自愈合水凝胶，其包括：1)含有bFGF或其他活性因子中的一种或几种的组合的、以壳聚糖谷氨酸盐(CSG)和四臂聚乙二醇苯甲醛(PEG-BA)为原料采用Schiff碱反应制备的自愈合水凝胶；和2)分散在1)中所述的自愈合水凝胶中的壳聚糖微球，所述壳聚糖微球含有TGFβ3或其他活性因子中的一种或几种的组合。9.根据以上8所述的多功能改性壳聚糖自愈合水凝胶，其可通过根据以上1-7中任一项所述的方法制备。10.根据以上8或9所述的多功能改性壳聚糖自愈合水凝胶在制备用于骨损伤(例如牙齿损伤，牙槽骨损伤)修复的药物中的应用，任选地/优选地所述多功能改性壳聚糖自愈合水凝胶与牙周膜干细胞(hPDLSCs)联合使用用于修复牙槽骨损伤。专利技术详述本专利技术人通过深入研究，发现不同生长因子在人牙周膜干细胞(hPDLSCs)成骨分化的过程中具有时空特异性，即bFGF促进其增殖和干性维持，TGFβ3促进其成骨分化，为此设计了一种次序释放bFGF和TGFβ3的自愈合水凝胶，原位注射于牙槽骨缺损部位，通过序贯释放不同生长因子来修复损伤的牙槽骨组织，为牙周组织工程领域的基础研究提供一种新的解决方案和修复手段。具体技术方案如下：一种多功能改性壳聚糖自愈合水凝胶的制备方法，其特征在于：其步骤包括：1)以壳聚糖为原料，采用乳化交联法制备壳聚糖微球；2)在壳聚糖微球溶液中加入TGFβ3，形成含有TGFβ3的壳聚糖微球；3)以壳聚糖谷氨酸盐和四臂聚乙二醇苯甲醛为原料，采用Schiff碱反应，制备自愈合水凝胶；4)将步骤3)中制备的自愈合水凝胶与一定量的bFGF混合，再与步骤2)中的含有TGFβ3壳聚糖微球混合，得到多功能改性壳聚糖自愈合水凝胶。壳聚糖是一种带正电的天然碱性多糖，由于其具备优良的生物相容性、生物降解性、无免疫原性以及抗细菌和真菌的特性，而被广泛应用于组织工程当中。bFGF释放，可以促进细胞增殖、促进血管生长和发育，为后续修复过程提供充足的营养物质，TGFβ3可以诱导原始的间充质干细胞迁移，同时在bFGF的辅助作用下，可促进间充质干细胞成骨分化。与传统水凝胶不同的是，自愈合水凝胶可凭借自愈性能最大化的避免包埋的药物分子泄露。此外，微球载体因其性质稳定，生物相容性好，可以负载各种药物(尤其是生物活性易丢失的多肽及蛋白类药物)，在体内通过缓慢降解，延长药物作用时间。本专利技术中，以壳聚糖为原料，结合凝胶和微球两种药物载体的优势，设计了一种可以序贯释放生长因子的凝胶体系。将TGFβ3载于微球中，载TGFβ3壳聚糖微球又悬浮于含bFGF的自愈合的水凝胶系本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多功能改性壳聚糖自愈合水凝胶的制备方法，包括以下步骤：/n1)以壳聚糖为原料，采用乳化交联法制备壳聚糖微球；/n2)制备壳聚糖微球的溶液，在所述壳聚糖微球的溶液中加入TGFβ3，形成含有TGFβ3的壳聚糖微球；/n3)以壳聚糖谷氨酸盐(CSG)和四臂聚乙二醇苯甲醛(PEG-BA)为原料，采用Schiff碱反应，制备自愈合水凝胶；和/n4)将步骤3)中制备的自愈合水凝胶与bFGF混合，再与步骤2)中制备的含有TGFβ3的壳聚糖微球混合，得到多功能改性壳聚糖自愈合水凝胶。/n

【技术特征摘要】
1.一种多功能改性壳聚糖自愈合水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
1)以壳聚糖为原料，采用乳化交联法制备壳聚糖微球；
2)制备壳聚糖微球的溶液，在所述壳聚糖微球的溶液中加入TGFβ3，形成含有TGFβ3的壳聚糖微球；
3)以壳聚糖谷氨酸盐(CSG)和四臂聚乙二醇苯甲醛(PEG-BA)为原料，采用Schiff碱反应，制备自愈合水凝胶；和
4)将步骤3)中制备的自愈合水凝胶与bFGF混合，再与步骤2)中制备的含有TGFβ3的壳聚糖微球混合，得到多功能改性壳聚糖自愈合水凝胶。


2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤1)中，将壳聚糖水溶液作为水相，将石油醚、液体石蜡、Span80、或它们的混合物作为油相，在搅拌下将所述水相加入所述油相，加入戊二醛交联，获得壳聚糖微球。


3.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤2)中，所述壳聚糖微球含有包括TGFβ3或其他活性因子中的一种或几种的组合。


4.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤3)中，所述自愈合水凝胶的制备方法如下：称取壳聚糖谷氨酸盐(CSG)粉末，于pH为7.4的PBS溶液中搅拌使其完全溶解，然后将其转移至含pH为7.4的PBS溶液的透析袋中透析至获得的壳聚糖谷氨酸盐溶液pH至6.8，室温保存备用；同时，称取四臂聚乙二醇苯甲醛(PEG-BA)粉末在超纯水中溶解完全，-20℃下保存备用；最...

【专利技术属性】
技术研发人员：项琪，黄亚东，于凤麟，
申请(专利权)人：广州暨南大学医药生物技术研究开发中心有限公司，肽源广州生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44