基于磁分离与固相单碱基循环延伸技术的单碱基差异检测方法技术

本发明专利技术公开了一种基于磁分离和固相单碱基循环延伸技术（ＳｉｎｇｌｅＢａｓｅ　Ｃｉｒｃｕｌａｒ　Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ，ＳＢＣＥ）的单碱基差异（Ｓｉｎｇｌｅ　Ｂａｓｅ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ，ＳＢＤ）检测新方法。其特征在于以磁性颗粒为载体固定待检测位点的延伸引物，在Ｔａｑ酶作用下将特定荧光标记的ｄｄＮＴＰ将延伸在引物３’端，通过包含有变性、退火和延伸的热循环反应，将模板的基因型信号放大。本发明专利技术具有简单、准确、低成本、高通量、高灵敏度的特点，并且该方法能够实现自动化运行，与传统方法相比该方法具有更高的实用性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因检测
，特别涉及 一 种基于磁分离与固相单碱 基循环延伸技术的单碱基差异检测方法。二
技术介绍
现有技术研究与遗传表型相关的DNA序列变异成为了后基因组 时代研究的主题之一。因此，对人类基因组中最常见的变异——单碱 基差异(Single Base Difference, SBD)的研究也成为了热点，其主要包 括单碱基的缺失，插入，置换，以及单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)。 SNP是人类基因组中最常见的单碱 基差异，在基因组中出现频率很高，据估计每300-1000个碱基中即出 现一次，分布密度远大于微卫星重复序列等，因而成为目前最常用的 第三代遗传标志物。在不同的人群中，SNP的频率分布有差异，这些 差异可以代表某一种族或人群间的遗传差异。因此，研究SNP有助于 解释个体的表型差异、不同群体和个体对疾病，特别是对复杂疾病的易感性，以及对各种药物的耐受性和对环境因子的反应。因此，建立 一种快速、准确、高通量且适用于临床的SNP检测方法具有时间上的 紧迫性，同时该方法应具备一定的通用性，能够对组织样本中低突变率 的SBD进行准确的检测。该种检测方法应具备以下特点 1)高通量具有真正高通量的特点，需要具备两个基本要素首先，该方法 能够实现阵列式的信号检测能力；其次，该方法能够实现高并行待检 测样本的制备。生物芯片技术的发展，为高通量的检测提供了良好的 技术平台，而高并行的样本操作和制备则更具有挑战性。 2 )自动化如果手动完成对大量样本的SBD检测，需要研究工作者耗费大量的 时间和精力。因此，这就需要我们提供一种能够实现自动化的检测方法。这种自动化的方法应该可以实现从样本的制备，分型操作， 一直 到最后的信号检测完全自动进行。 3 )准确性准确是对于SBD检测方法的基本要求。尤其是对于肿瘤样本来说，由于癌组织中的突变率往往很低，常规的杂交检测方法由于错配 杂交产生的假阳性信号，往往无法准确进行突变检测。当然，简单和易用性以及低成本也是SBD检测应具备的特点。 随着纳米技术的迅速发展，纳米材料逐渐被应用到生命科学领 域，为其研究和发展提供了新的技术和手段。具体关于磁性颗粒的制 备可参考以下文献Jun Lin, et al. Jowr冊/ 5Va/e C/ze脂、/ry 159,26-31 (2001); XC Shen,C/ 纖.,Vol.33, No.11,1468-1469 (2004);Eugenii Katz, C/z亂/W. 2004, 43, 6042-6108.由于磁性纳米颗粒分离生物分子时具有分离速度快、效率高、可 重复使用、操作简单、易实现功能基团、易实现自动化以及不影响分 离物质的活性等特殊的物理化学性质和生物相容性，目前已被广泛应 用于细胞的分离、免疫测定、蛋白质和酶的固定以及DNA的检测 等。
技术实现思路
技术问题本专利技术针对现有技术空白，提供一种将纳米技术与单 碱基循环延伸技术相结合，建立一种新型的简单、高准确性、低成 本、高通量的SBD检测方法，整个方法能够实现从自动化分行，且与 传统方法相比该方法应要具有很高的实用性和灵活性。技术方案 一种基于磁分离与固相单碱基循环延伸技术的单碱基差异检测方 法，其特征在于;f企测步骤为a. 磁性纳米颗粒的修饰对无荧光背景的磁性颗粒表面进行 功能化修饰，使磁性颗粒表面具有特定化学基团或生物大 分子，所述特定化学基团或生物大分子为胶体金、亲合素 或醛基；b. 设计引物的修饰选取待检测的重要功能SNP位点或突变 位点，根据上述位点碱基序列设计单碱基循环延伸引物， 所设计的引物5'端经过功能化修饰有与磁性颗粒表面胶体金、亲合素或醛基对应的巯基、生物素或氨基，3'端最后 一个碱基与待4全测位点的上游一个石咸基互补；c. 固相引物的制备通过共价结合法，将一端有标记物的单 碱基循环延伸引物通过胶体金_巯基、亲合素-生物素或 者醛基-氨基之间的共价结合固定在修饰的磁性颗粒上， 制备固相引物；d. 延伸反应延伸反应的体系中包括固相延伸引物，模板 DNA ,与待检测相关 SNP位点相对应的荧光标记的 ddNTP， Mg2+、 lxTaq酶緩冲液、TaqDNA聚合酶，通过 95'C变性、退火，耙序列和延伸引物结合，在TaqDNA聚 合酶的作用下，与待4全测位点相对应的焚光标记的ddNTP 将延伸在引物3'端，在新的一个循环中，靶序列通过与另 一条引物互补，将荧光标记的ddNTP通过延伸连接在新的 引物上，如此若干循环后，延伸引物的3'端都将连接上荧 光标记物；e. 经过若干个循环后，将延伸荧光标记物的磁性颗粒经充分 洗涤，通过检测磁性颗粒表面的荧光强度来实现对样本的 SBD检测。上述方法中所使用延伸模板为基因组DNA或者PCR产物作为延 伸模板，在Taq酶的作用下，通过热循环延伸后在延伸引物上延伸出 荧光标记的ddNTP。上述方法中所循环延伸所使用的萸光标记的ddNTP只与待检测位 点互补，所述焚光标记的ddNTP为单色焚光标记或为双色焚光标记。上迷方法中步骤(e)中磁性颗粒表面的焚光强度用生物芯片扫描仪 4金测或用纟鼓孔板^r测。有益效果本专利技术在磁性颗粒制备方面采用了通过在磁性纳米材料表面修饰 金壳或凝胶壳，有效消除磁性纳米颗粒的荧光背景。利用磁性颗粒作 为单碱基循环延伸反应的固相载体，本专利技术具有制备简单，易于自动 化，检测快速，灵敏度高等优点。能够在较小的空间区域内固定更大 量的荧光探针，从而实现信号放大。本专利技术首次提出了固相单碱基循环延伸技术。该技术与常规单碱 基延伸技术相比，能够同时使用基因组DNA、全基因组扩增产物或者 PCR扩增产物作为靶序列，避免对靶序列的纯化、浓缩。利用磁性颗 粒作为载体，直接通过在颗粒表面循环延伸荧光标记的ddNTP或者将 循环延伸后3，端连接有萸光标记物的延伸引物固定到磁性颗粒上，从 而获取样本的分型信息，实现了对分型信号的二次放大。应用磁性颗粒作为载体，该方法能够实现从样本制备——分型操 作——信号检测的完全自动化。循环延伸和^f兹性颗粒为针列的应用， 使得样本分型信号强度大，正错配信号比高。由于实验中仅需要荧光 标记的ddNTP，无须其他昂贵的荧光探针，大大降低了实验成本。因 而应用该方法能够实现对大量样本多个SBD位点的高准确性、低成 本、高通量、自动化的检测。综上所述，本专利技术克服了目前SBD检测方法的许多不足，具有操 作简单、快速、高通量、高灵敏度等优点，有较高的应用价值。四具体实施方式 实施例1:一种，检测步 骤为磁性纳米颗粒的修饰对无焚光背景的磁性颗粒表面进行功能 化修饰，使磁性颗粒表面具有特定化学基团或生物大分子，所述特定 化学基团或生物大分子为胶体金、亲合素或醛基；设计引物的修饰 选取待检测的重要功能SNP位点或突变位点，根据上述位点碱基序列 设计单碱基循环延伸引物，所设计的引物5'端经过功能化修饰有与磁 性颗粒表面胶体金、亲合素或醛基对应的巯基、生物素或氨基，3，端 最后一个碱基与待检测位点的上游一个碱基互补；固相引物的制备 通过共价结合法，将一端有标记物的单碱基循环延伸引物通过胶体金 -巯基、亲合素-生物素或者醛基-氨基本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于磁分离与固相单碱基循环延伸技术的单碱基差异检测方法，其特征在于检测步骤为：　ａ．磁性纳米颗粒的修饰：对无荧光背景的磁性颗粒表面进行功能化修饰，使磁性颗粒表面具有特定化学基团或生物大分子，所述特定化学基团或生物大分子为胶体金、亲合素或醛基；　ｂ．设计引物的修饰：选取待检测的重要功能ＳＮＰ位点或突变位点，根据上述位点碱基序列设计单碱基循环延伸引物，所设计的引物５’端经过功能化修饰有与磁性颗粒表面胶体金、亲合素或醛基对应的巯基、生物素或氨基，３’端最后一个碱基与待检测位点的上游一个碱基互补；　ｃ．固相引物的制备：通过共价结合法，将一端有标记物的单碱基循环延伸引物通过胶体金－巯基、亲合素－生物素或者醛基－氨基之间的共价结合固定在修饰的磁性颗粒上，制备固相引物；　ｄ．延伸反应：延伸反应的体系中包括固相延伸引物，模板ＤＮＡ，与待检测相关ＳＮＰ位点相对应的荧光标记的ｄｄＮＴＰ，Ｍｇ↑［２＋］、１×Ｔａｑ酶缓冲液、ＴａｑＤＮＡ聚合酶，通过９５℃变性、退火，靶序列和延伸引物结合，在ＴａｑＤＮＡ聚合酶的作用下，与待检测位点相对应的荧光标记的ｄｄＮＴＰ将延伸在引物３’端，在新的一个循环中，靶序列通过与另一条引物互补，将荧光标记的ｄｄＮＴＰ通过延伸连接在新的引物上，如此若干循环后，延伸引物的３’端都将连接上荧光标记物；　ｅ．经过若干个循环后，将延伸荧光标记物的磁性颗粒经充分洗涤，通过检测磁性颗粒表面的荧光强度来实现对样本的ＳＢＤ检测。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李松，何农跃，刘洪娜，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]