一种测定细菌产纤维素酶的胞内碳源诱导物的方法，它涉及了一种测定细菌产酶诱导物的方法。本发明专利技术解决了目前缺乏一个有效的测定细菌产纤维素酶的胞内碳源诱导物的方法。本发明专利技术测定细菌产纤维素酶的胞内碳源诱导物的方法按照如下步骤进行：一、各种碳源对纤维素酶产生的诱导作用；二、在菌株的对数生长期内获得菌体；三、细菌胞内酶和胞膜酶的制备；四、各酶制备物与底物的反应；五、高效液相色谱；与标准品的保留时间相同的即为细菌产纤维素酶的胞内碳源诱导物。本发明专利技术的方法可明确细菌胞内产纤维素酶的胞内碳源诱导物。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种测定细菌产酶诱导物的方法。技术背景纤维素酶是多酶体系，受着复杂的代谢调控。酶产量及酶的比活力低一直 是影响纤维素酶实际应用的一个重要原因，阐明纤维素酶诱导形成的机制和调 节控制的原理，不仅有着理论上的意义，而且将为改变培养条件提高纤维素酶 产量，设计筛选模型选育高产菌种提供新的线索和手段。过去人们对纤维素酶的诱导调节机制的研究多集中于木霉(rn'c/20&rmfl)等少数真菌菌株，有关 细菌产生纤维素酶的机制了解得非常少。在真菌纤维素酶的研究中，虽发现了 几种可诱导菌体产生纤维素酶的诱导物，但难以用真菌的诱导机理来解释细菌 的诱导现象。因为， 一方面目前人们对什么是纤维素酶合成的真正诱导物仍然 存有争议，在以往所报道的文献中出现了很多有关何种物质是诱导物的报道； 另一方面不能够确定胞外可诱导产酶的碳源在进入到细胞后，是否被胞壁酶或 胞内酶转化为其它物质而起诱导作用或胞外诱导物不经任何转化而直接进入 胞内起诱导作用。目前缺乏一个有效的测定细菌产纤维素酶的胞内碳源诱导物 的方法。
技术实现思路
本专利技术是为了解决目前缺乏一个有效的测定细菌产纤维素酶的胞内碳源 诱导物的方法，而提供。本专利技术测定细菌产纤维素酶的胞内碳源诱导物的方法按照如下步骤进行 一、各种碳源对纤维素酶产生的诱导作用在待测细菌的诱导产酶无机盐培养 基中分别添加不同的碳源，使碳源的体积浓度均为0.5%，用4mL无菌水将菌 体斜面培养物制成菌悬液，然后取0.3mL菌悬液平行接入装有30mL发酵培养 基的两个150mL三角瓶中，在30。C的条件下，以170r/min的速度进行振荡培 养，每隔24h取样，将样品以4000r/min的速度离心15min，沉淀即为菌体， 称量湿菌体的重量，并同时测定上清液对CMC、滤纸、微晶纤维素、棉花的 活力及(3-葡萄糖苷的酶活，连续测定5天，每种酶活的测定平行操作三次，然 后取平均值，计算单位湿菌体的产酶量；二、在菌株的对数生长期内获得菌体； 三、细菌胞内酶和胞膜酶的制备用接菌环挑取一环菌体斜面培养物接入装有 30mL种子培养基的150mL三角瓶中，在3(TC的条件下，以170r/min的速度 振荡培养10h，按l。/。的体积比接入装有200mL增菌培养基的三角瓶中，在30 'C的条件下，以170r/min下振荡培养至对数末期，以1000r/min的速度离心 10min收获菌体，用pH值为7.2的磷酸盐缓冲液离心洗涤一次，按每克湿菌 体需要加入10mL、 pH值为7,2的磷酸盐缓冲液的比例悬浮菌体，将此菌悬液 移入一不锈钢或玻璃容器内，置冰水浴中，将超声振荡器探头浸入液面以下约 2~3mm，调节超声振荡器的输出功率为500W，工作30s，停30s，循环30次， 再以1000r/min的速度离心10min，然后以20000r/min的速度离心20min，沉 淀层即为细胞壁和细胞膜层，上清层为胞内层，将沉淀层和上清层分别对去离 子水于4'C透析过夜，透析液中叠氮钠的质量浓度为0.02%;四、各酶制备物与底物的反应用去离子水将各种可诱导菌体产纤维素酶的糖和各酶制备物均配成20mg/mL的初始浓度，按1:1的体积比混合，将反应混合物放入37"C水 浴反应24h，然后在(TC的条件下以16000r/min的速度离心30min，收集上清 用于高效液相色谱的检测；五、高效液相色谱条件色谱柱为High Performance Carbohydrate Column (高效糖柱)4.6x250mm，流动相为的乙腈与按照75:25 的体积比混合的混合液，流速为1.4mL/min，检测器为示差折光检测器，上样 量为15pL，每个样品平行操作三次；与标准品的保留时间相同的即为细菌产 纤维素酶的胞内碳源诱导物。本专利技术测定细菌产纤维素酶的胞内碳源诱导物的方法的原理为步骤一为 测定单位湿菌体的产酶量，产酶量的测定是为了初步确定胞外可诱导菌体产纤 维素酶的碳源；步骤三为制备细菌胞内酶和胞膜酶，其作用是确定在胞外可诱 导产酶的碳源在进入到细胞后，是否被胞壁酶或胞内酶转化为其它物质而起诱 导作用或胞外诱导物不经任何转化而直接进入胞内起诱导作用；步骤四和步骤 五为高效液相色谱的测定，高效液相色谱的测定是为了对胞膜酶和胞内酶作用 于胞外诱导物后的产物进行定性分析，以确定菌体胞内产酶的真正碳源诱导 物。本专利技术测定细菌产纤维素酶的胞内碳源诱导物的方法具有步骤少、操作简 单、用时短、费用低廉、无需昂贵的实验材料和特殊仪器的优点，本专利技术的方 法可明确细菌胞内产纤维素酶的胞内碳源诱导物，这是从分子水平上全面弄清 细菌产纤维素酶诱导机制的必不可少的前期步骤，用本专利技术的方法测定出细菌 产纤维素酶的直接诱导物用以提高酶的产量。具体实施方式本专利技术技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方 式间的任意组合。具体实施方式一本实施方式测定细菌产纤维素酶的胞内碳源诱导物的方 法按照如下步骤进行 一、各种碳源对纤维素酶产生的诱导作用在待测细菌 的诱导产酶无机盐培养基中分别添加不同的碳源，使碳源的体积浓度均为0.5%，用4mL无菌水将菌体斜面培养物制成菌悬液，然后取0.3mL菌悬液平 行接入装有30mL发酵培养基的两个150mL三角瓶中，在30。C的条件下，以 170r/min的速度进行振荡培养，每隔24h取样，将样品以4000r/min的速度离 心15min，沉淀即为菌体，称量湿菌体的重量，并同时测定上清液对CMC、 滤纸、微晶纤维素、棉花的活力及l3-葡萄糖苷的酶活，连续测定5天，每种酶 活的测定平行操作三次，然后取平均值，计算单位湿菌体的产酶量；二、在菌 株的对数生长期内获得菌体；三、细菌胞内酶和胞膜酶的制备用接菌环挑取 一环菌体斜面培养物接入装有30mL种子培养基的150mL三角瓶中，在30°C 的条件下，以170r/min的速度振荡培养10h，按1%的体积比接入装有200mL 增菌培养基的三角瓶中，在30。C的条件下，以170r/min下振荡培养至对数末 期，以1000r/min的速度离心10min收获菌体，用pH值为7.2的磷酸盐缓冲 液离心洗涤一次，按每克湿菌体需要加入10mL、 pH值为7.2的磷酸盐缓冲液 的比例悬浮菌体，将此菌悬液移入一不锈钢或玻璃容器内，置冰水浴中，将超 声振荡器探头浸入液面以下约2 3mm，调节超声振荡器的输出功率为500W， 工作30s，停30s，循环30次，再以1000r/min的速度离心10min，然后以 20000r/min的速度离心20min，沉淀层即为细胞壁和细胞膜层，上清层为胞内 层，将沉淀层和上清层分别对去离子水于4。C透析过夜，透析液中叠氮钠的质 量浓度为0.02%;四、各酶制备物与底物的反应用去离子水将各种可诱导菌 体产纤维素酶的糖和各酶制备物均配成20mg/mL的初始浓度，按1:1的体积 比混合，将反应混合物放入37'C水浴反应24h，然后在0-C的条件下以 16000r/min的速度离心30min,收集上清用于高效液相色谱的检测；五、高效 液相色谱条件色谱柱为High Performance Carbohydrate Column (高效糖柱) 4.6x250mm，流动本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种测定细菌产纤维素酶的胞内碳源诱导物的方法，其特征在于测定细菌产纤维素酶的胞内碳源诱导物的方法按照如下步骤进行：一、各种碳源对纤维素酶产生的诱导作用：在待测细菌的诱导产酶无机盐培养基中分别添加不同的碳源，使碳源的体积浓度均为０．５％，用４ｍＬ无菌水将菌体斜面培养物制成菌悬液，然后取０．３ｍＬ菌悬液平行接入装有３０ｍＬ发酵培养基的两个１５０ｍＬ三角瓶中，在３０℃的条件下，以１７０ｒ／ｍｉｎ的速度进行振荡培养，每隔２４ｈ取样，将样品以４０００ｒ／ｍｉｎ的速度离心１５ｍｉｎ，沉淀即为菌体，称量湿菌体的重量，并同时测定上清液对ＣＭＣ、滤纸、微晶纤维素、棉花的活力及β－葡萄糖苷的酶活，连续测定５天，每种酶活的测定平行操作三次，然后取平均值，计算单位湿菌体的产酶量；二、在菌株的对数生长期内获得菌体；三、细菌胞内酶和胞膜酶的制备：用接菌环挑取一环菌体斜面培养物接入装有３０ｍＬ种子培养基的１５０ｍＬ三角瓶中，在３０℃的条件下，以１７０ｒ／ｍｉｎ的速度振荡培养１０ｈ，按１％的体积比接入装有２００ｍＬ增菌培养基的三角瓶中，在３０℃的条件下，以１７０ｒ／ｍｉｎ下振荡培养至对数末期，以１０００ｒ／ｍｉｎ的速度离心１０ｍｉｎ收获菌体，用ｐＨ值为７．２的磷酸盐缓冲液离心洗涤一次，按每克湿菌体需要加入１０ｍＬ、ｐＨ值为７．２的磷酸盐缓冲液的比例悬浮菌体，将此菌悬液移入一不锈钢或玻璃容器内，置冰水浴中，将超声振荡器探头浸入液面以下约２～３ｍｍ，调节超声振荡器的输出功率为５００Ｗ，工作３０ｓ，停３０ｓ，循环３０次，再以１０００ｒ／ｍｉｎ的速度离心１０ｍｉｎ，然后以２００００ｒ／ｍｉｎ的速度离心２０ｍｉｎ，沉淀层即为细胞壁和细胞膜层，上清层为胞内层，将沉淀层和上清层分别对去离子水于４℃透析过夜，透析液中叠氮钠的质量浓度为０．０２％；四、各酶制备物与底物的反应：用去离子水将各种可诱导菌体产纤维素酶的糖和各酶制备物均配成２０ｍｇ／ｍＬ的初始浓度，按１∶１的体积比混合，将反应混合物放入３７℃水浴反应２４ｈ，然后在０℃的条件下以１６０００ｒ／ｍｉｎ的速度离心３０ｍｉｎ，收集上清用于高效液相色谱的检测；五、高效液相色谱条件：色谱柱为Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｃｏｌｕｍｎ ４．６×２５０ｍｍ，流动相为的乙腈与按照７５∶２５的体积比混合的混合液，流速为１．４ｍＬ／ｍｉｎ，检测器为示差折光检测器，上样量为１５μＬ，每个样品平行...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：燕红，杨谦，
申请(专利权)人：哈尔滨工业大学，
类型：发明
国别省市：93[中国|哈尔滨]
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