肠道病毒Cox A16核酸荧光定量RT-PCR检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术提供了一种肠道病毒柯萨奇Ａ１６型（Ｃｏｘ　Ａ１６）核酸荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ检测试剂盒及检测方法。所述荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ检测试剂盒的上下游引物和特异性探针序列如下：上游引物ＣＡ１６ＹＧＦ：５’－ＧＧＧＡＡＴＴＴＣＴＴＴＡＧＣＣＧＴＧＣ－３’；下游引物ＣＡ１６ＹＧＲ：５’－ＣＣＣＡＴＣ　ＡＡＲ　ＴＣＡＡＴＧ　ＴＣＣＣ－３’；特异性探针ＣＯＸＡ１６ＰＢ：５’－ＡＣＡＡＴＧＣＣＣＡＣＣＡＣＧＧＧＴＡＣＡＣＡ－３’；本发明专利技术方法对肠道病毒Ｃｏｘ　Ａ１６的检测有高度的特异性，与其他肠道病毒无交叉反应，且灵敏度达０．１ＴＣＩＤ↓［５０］，可直接从疑似手足口病患者的脑脊液、疱疹液和粪便等标本中检测肠道病毒Ｃｏｘ　Ａ１６核酸，从病毒核酸提取至完成检测仅需３ｈ左右，非常适用于手足口病等由肠道病毒Ｃｏｘ　Ａ１６感染引起突发疫情的实验室早期诊断。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种肠道病毒柯萨奇A16型(Cox A16)核酸焚光定量 RT-PCR检测试剂盒及检测方法，可应用于手足口病等暴发疫情的实验室 应急;险测。(二)
技术介绍
手足口病(Hand foot mouth disease HFMD )是婴幼儿常见的传染病， 临床上以发热和手、足、口腔等部位出现皮渗、溃疡等表现为主，个別患 者可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等致命性并发症，手足口病是 全球性传染病，世界大部分地区均有此病流行的报导。手足口病一般是由肠道病毒引起的一种急性传染病，近年中国手足口 病的爆发流行引起了全球的关注，卫生部已将手足口病纳入国家丙类法定 报告传染病，通过网络直报系统对疫情进行监测。由于HFMD是由多种人肠道病毒感染引起，其中以EV71及CoxA16 型最为常见，为了对该病迅速查明病因，及时采取控制措施，急需进行实 验室快速诊断，但肠道病毒传统的检测方法是病毒分离和中和法定型，繁 瑣费时，不适合早期诊断。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种手足口病感染实验室应急检测的肠道病毒 Cox Al6型荧光RT-PCR纟企测试剂盒及检测方法。 本专利技术采用的技术方案是肠道病毒Cox A16核酸荧光定量RT-PCR检测试剂盒，所述焚光定量 RT-PCR检测试剂盒的上下游引物和特异性探针序列如下 上游引物CA16YGF: 5，-GGGAATTTCTTTAGCCGTGC- 3， 下游引物CA16YGR: 5 ，-CCC ATC AA R TCA ATG TCC C- 3 ， 特异性^果针COXA16PB: 5'-ACA ATG CCC ACC ACG GGT ACA CA -3，引物CA16YGR序列中，碱基R为A或G的兼并碱基，此处为引物 的突变位点，就是说该处有些病毒是A,有些是G。而在引物的合成工艺 过程中，其合成原理是到这个位点时，原料各加一半也就是加一半A,加 一半G。本试剂盒中关键组分为引物和探针序列，此外还包括dNTP, MgCl2， RNase抑制剂，AMV逆转录酶，Taq酶等，这些组分对于本领域技术人 员来说属于公知常识，可根据需要选用。本专利技术还涉及一种肠道病毒Cox A16核酸焚光定量RT-PCR检测方 法，所述方法包括(1)根据肠道病毒Cox A16基因序列，设计上下游引物和特异性探 针序列如下CA16YGF: 5，-GGGAATTTCTTTAGCCGTGC- 3' CA16YGR: 5'画CCC ATC AAR TCAATG TCC C- 3' COXA16PB: 5，-ACA ATG CCC ACC ACG GGT ACA CA -3' 引物CA16YGR序列中，碱基R为A或G的兼并碱基。(2 )提取待测样品RNA,以待测样品RNA为模板、在包括步骤(1 ) 所述引物和探针序列的RT-PCR反应体系中进行RT-PCR反应；(3)对RT-PCR反应产物进行焚光检测，根据荧光检测的最低Ct值和最高焚光强度判断结果，若荧光RT-PCR反应呈阳性，则待测样品含有肠道病毒Cox A16核酸。 本专利技术关键在于引物和探针序列的设计，RT-PCR反应体系组成、反 r件选择和反应结果判断均可按本领域常规方法进行。 优选的，所述RT-PCR反应体系终浓度组成如下 RT-PCR緩冲液 终浓度为lx0.1 U/fiL 0.1 U/^iL 各1.60 (xM 0.80 (iMX X ng/|uLEx Taq HS RT Enzyme Mix II 上游与下游引物 探针模板RNA DEPC水补足至25 ju L。所述RT-PCR緩冲液为one step RT-PCR緩沖液，其终浓度为1 x , 是指緩沖液各组分在反应体系中的终浓度与1 x one step RT-PCR緩冲液 中各组分的浓度相同。通常采用反应体系1/2体积的2 x one step RT-PCR 緩冲液。1 x one step RT-PCR buffer的具体组成参照Takara公司的one step Prime Script RT-PCR ( Perfect Real time) ， Code: DRR064A。所述RT-PCR反应条件为42°C 30min, 95°C 2min进行逆转录，然后95。C5s, 51°C 35s,在5rC进行单点焚光检测，共进行40个循环。 所述样品RNA提取可按常规方法进行，如采用德国QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit或其它试剂盒，按照试剂盒说明书进行提取。手足口病是由多种人肠道病毒感染引起，其中以EV71及CoxA16型最为常见，对手足口病爆发疫情尽早作出实验室确诊是及时采取防控措施与对诊治疗的关键。肠道病毒检测传统的方法是采用细胞培养进行病毒分 离，然后用肠道病毒组合血清进行型别鉴定，该方法虽然正确可靠，但繁 杂耗时，不适应早期应急诊断。近年来，随着分子生物学技术的发展，采用RT-PCR技术对肠道病毒进行诊断国内外已有报导，它具有灵敏度高， 特异性强，所需时间短等优点，目前已在肠道病毒的核S吏;险测中得到应用， 但其岸企测时间仍需6 ~ 7 h，且容易由于PCR扩增产物污染而产生假阳性。近几年发展起来的以特异性荧光探针为特点的荧光定量PCR技术， 实行完全闭管式操作，不仅能大大减少扩增产物污染的机会，而且较常规 RT-PCR技术，无论从敏感性，特异性与速度上都更具有优势，当然它对 引物和探针的设计也提出了更高的要求。本申请专利技术人从美国的NCBI基因库上下载了近二十年来世界各地 的肠道CoxA16毒林，对其进行了同源性比较，在CoxA16的VPl区设 计若干对引物与Taqman探针，对该区域进行特异性扩增，从中筛选出最 佳的引物和探针，并对荧光RT-PCR方法进行优化，验证其敏感性、特异 性和重复性。经肠道病毒标准抹、CoxA16毒抹与近期手足口病爆发疫情 疑似患者临床样本的检测比较，该方法具有高特异性，只能检出肠道病毒 CoxA16型，与其他肠道病毒如柯萨奇A组CoxA4、 CoxA16、 CoxA21、 CoxB5、艾苛病毒E6、 E30、 EV71、 POLIO I型等毒林均无交叉反应， 而且比常规RT-PCR法更敏感、快速和简便。肠道病毒CoxA16的RT-PCR 检测敏感度在l.OTCIDso左右，从病毒核酸提取、RT-PCR反应与电泳， 整个过程大约需6~7 h左右，而采用本方法从核酸提取至完成检测，仅 需3h左右，能同时完成多个疑似患者临床样本的高通量检测，敏感度达 0.1 TCID5Q,比普通PCR的灵敏度高IO倍左右，可直接从手足口病患者的脑脊液、粪便、疱渗液等临床样本中检测肠道病毒Cox A16核酸。用建立的新方法，对近期浙江省疑似手足口病爆发疫情疑似患者80份临床样本进行实验室早期快速诊断，获得了令人满意的结果，为该病及时采取 控制措施发挥了很好的作用。本专利技术的有益效果主要体现在本专利技术方法对肠道病毒Cox A16的 检测有高度的特异性，与其他肠道病毒EV71、 CoxA4、 CoxA21、 E6、 E30、 CoxB5、 POLIO等病毒无交叉反应；本专利技术方法检测的灵敏度达 0.1TCID5。，可直接从疑似手足口病患者的脑脊液、疱渗液本文档来自技高网...

【技术保护点】
肠道病毒Ｃｏｘ　Ａ１６核酸荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ检测试剂盒，其特征在于所述荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ检测试剂盒的上下游引物和特异性探针序列如下：　ＣＡ１６ＹＧＦ：５’－ＧＧＧＡＡＴＴＴＣＴＴＴＡＧＣＣＧＴＧＣ－３’　ＣＡ１６ＹＧＲ：５ ’－ＣＣＣ　ＡＴＣ　ＡＡ　Ｒ　ＴＣＡ　ＡＴＧ　ＴＣＣ　Ｃ－３’　ＣＯＸＡ１６ＰＢ：５’－ＡＣＡ　ＡＴＧ　ＣＣＣ　ＡＣＣ　ＡＣＧ　ＧＧＴ　ＡＣＡ　ＣＡ－３’　引物ＣＡ１６ＹＧＲ序列中，Ｒ为Ａ或Ｇ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：徐昌平，卢亦愚，严菊英，冯燕，陈寅，
申请(专利权)人：浙江省疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]