荧光测定法制造技术

本发明专利技术公开了通过分别地估测归因于固有滤波效应的不依赖于时间的改变，和估测由测定化学所引起的依赖于时间的改变而估测荧光测定中非荧光物质（例如，血红蛋白）浓度的方法和装置。这种方法排除了单独的光测或其它测定的需要，因此简化了方法学和相关的装设仪器。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉^t样品中非荧光物质进行测定的方法，进一步地涉及用于根据这种 方法进行测定的装置。
技术介绍
欧洲专利号EP 0,772,779描述了通过荧光猝灭的糖化蛋白质的测定法。如该文 献所示例的现有技术描述了利用荧光猝灭的糖ftjfe红蛋白的测定法，所述荧光猝灭 是当所述糖化血红蛋白结^il过特定荧光团与硼酸基团的化学连接产生的缀合物时 产生的。然后，这种依赖于浓度的猝灭与通过现有技术确定的传统光度测定法所测 定的总血红蛋白的测定进行比较。然而，在该现有技术方法期间，存在不可避免的非特异性水平的荧光猝灭，其 不是由所述缀合物与糖ftjfiL红蛋白结合弓胞的，而是由固有的搶波效应弓胞的。这 种固有的澹波效应是由血红蛋白分子本身所弓胞的，该血红蛋白分子本身吸收由血 红蛋白吸收光谱与荧光激发和发射光谱的光谱重叠所引起的激发辐射和发射的荧 光。在计算中必须补偿这种背景荧光猝灭，以允辩寺定猝灭的定量，该特定猝灭只 是归因于糖化血红蛋白的浓度和由此它的量子。EP 0,772,779的专利技术A31过在适合 的波长(例如，405nm或415nm)测定反应溶液的光密度，和根据该光密度测定减去总荧光猝灭的按比例要素，完成了这个。在EP 0,772,779中公开的方法中，利用传统的光测方法诸如，在405nm或415nm 吸光度测定总血红蛋白浓度。对于如这里所述的起作用的方法，使用者必须在3fc^ 的仪器上进行两个独立的测定光度计测定总的光密度和荧光计测定荧光猝灭。对 于具有任何商业应用的检验，例如在糖尿病治疗中，为该检验特定设计和制造的任 何仪器必须因此具有荧光计和光度计的双功能性。这是昂贵的，更复杂的和不期望 的。如EP0，772，779中所描述的通ffll红蛋白的荧光猝灭具有两个组成。首先，在 荧光激发和;Elt波长，与血红蛋白样品结合的初始瞬间荧光下降就象中性密度滤光 片一样起作用；其次，与糖化血红蛋白和荧光缀合物试齐啲化学结合的时间过程相关的依赖于时间的荧光信号猝灭。
技术实现思路
如上所述和下面进一步讨论的，本专利技术的目的是克服现有技术方法的问题，希 望开发出显著改进的测定方法，以及设计一种自动获得期望结果的仪器。作为该仔 细研究的结果，本专利技术人已经确定鹏下面的荧光改变时间过程作为观啶反应进程, 可以从〈繊于时间的荧光猝灭单独测定不依赖于反应化学的背景荧光改变，即，瞬 时减少或增加，该依赖于时间的荧光猝灭归因于耙化合物与荧光试剂的化学结合。 从这个出发，他们也已经发现当向荧光试齐麟加物质时，测定荧光的改变，尤其是 猝灭效应的改变可以用于计算本身不是荧光的物质的浓度。根据本专利技术的第一方面，本专利技术提供了一种对样品中非荧光物质进行测定的方 法，该方法包括(a) 在溶液中进行测定样品和荧光标记化合物之间的反应，在时间to，样品 和标记化合物结合；(b) 激发标记化合物中的荧光，其中标记物的性质和激发的性质是这样的 艮P，在通过标记化合物和非荧光物质的反应改^^述荧光的波长发生所 述的荧光；(c) 随着反应进程检测所引起的荧光；(d) 从所检测的荧光计算Fo和F4直，Fo是在时间to时的荧光，F。是在时间t 时的荧光，这是所有的非荧光物质已经与标记化合物反应，或者反应已 经达到平衡时的点；(e) 从F。和F4直计算由于步骤(a)中反应的荧光中背景改变；和(f) 从所计算的值和适合的校准算法，确定与荧光标记化合物反应之前，在 to时，样品中存在的非荧光物质的浓度。如这里所用的，当提到待要测定的物质(分析物)时，术语非荧光不意指物质 完全是非荧光的。而是它意指在相关的激发和對寸波长，它具有对荧光标记化合物 的不同激发和或^l寸光谱。本专利技术的目前主要期望的应用，液中糖4t血红蛋白的测定。实际上，本专利技术 的起源在于改善该测定的方法，特别是测定样品中糖化血红蛋白(gP，葡萄糖已经 非酉鞭地结合的血红蛋白)的数量或比例。因为这个原因，尽管本专利技术同样可以应用于许多不同物质，特别是这样的物质，其中样品含量的吸收特征易于干iffi合荧光团的荧光特征的物质的测定，下面的说明书将更经常地在这方面描述本专利技术。本专利技术的第一方面需要对待测定物质特异的标记化合物和由于标记物和物质的结合而适合地改变(可能是增加，但是更经常地是减少)的荧光。标记化合物通常将包含荧光团和适合选择性结合物质的连接基团。可以基于实验检验或基于现存荧光团和连接基团相对于待检测物质的已知特征进行针对特定耙物质的适合荧光团和连接基团眹合的选择。在EP772,779中提到了一系列已知的荧 光团，其内容在这里并入为参考文献。对于糖化蛋白质诸如糖4她红蛋白，适合的 丰gi己可以包含硼酸基团，其通过连接基团结合荧光素衍生物。硼酸结合糖化蛋白质 的顺式二醇基团，但不是蛋白质特异的。优选地，该方纟彭待别地适合糖化血红蛋白 和可能具有下列结构式的适合标记物的检测在(f)部分中所用的校准算法可以具有公式y二mx+c，其中m和c是斜率和 截距校准常数，x二 (FQ—F ) / Fo。靶非荧光物质可以是主物质(例如，所有形式 的总血红蛋白)的亚禾中(例如，糖化血红蛋白)，并且与主物质比较，亚种将选择性 地与标记化合物反应。在这种情况下，可以期望知道与荧光标记化合物反应前，to 时样品中存在的主物质(包括亚种)的总浓度。这可以从计算值和公式y二m，x+c， 的适合校准算^*确定；其中m，和c，^斜率和截距校准常数，x=Log (FBlank/F0)。在步骤(d)中F。和F4直的计算tt地包括根据时间绘制检测的荧光数据，和对标绘点应用最佳适合曲线。绘制可以是实际的，乃至手动的，但是常常通过f吏最 佳适合曲线的数学函数适合于数据，并且外推该函数至时间to和U来自动和数学地 获得该绘制，而不用产生这种图表。可以通过任何适合的数学方法获得曲线适合， 并且在该说明书的后面描述两种特别适合的数学方法。利用这些体系，所记录的数 据用于最小化差异，然后外推该曲线以提供F。和F4直在完全自动的仪器系统中，当向试剂添加血液，并且通过仪器混合时，在血液 添加和混合后最初的大约5秒内可能观啶初始的猝灭。然而，在非自动的系统中， 由于操作者向包含试齐啲反应池物理地添加血液样品，混合及将反应池返回荧光计 所需要的有限时间，进一步延迟了初始结合反应的监测。因此，血液样品添加后在 to时的即刻实际的荧光水平不育^在手动或自动系统中直接地被测定。为了克服该问题，在时间to时，艮口，样品添加和混合后，但是反应发生前即刻的荧光7jC平Fo是基于化学结合反应的速率公式，通过适合于时间过程荧光数据的曲线后退外推而被确 定。而且，通过数据收集期间以外的该曲线适合的前进夕滩，也确定了在时间t』寸，反应端点的荧光水平F^该方法中在to和U时确定荧光水平已经表明产生了可靠和精确的结果。观啶反应混合物荧光的时间期间可以题合于观啶法使用的任何时间期间。长 的期间给出了更大的精确性，但是较慢的测定过程，而短的期间是方便的，但是可 以弓胞不太精确的结果，因为外推的数据量稀少。测定期间的适合长度将取决于被 领啶的物质禾咜与荧光标记物反应的时间表。在血红蛋白硼化物结合顺式二醇基团 的情况下，约3分钟的测定期间通常是合适的。iM地，在步骤(a)中，样品与标本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种对测定样品中非荧光物质进行测定的方法，该方法包括：　（ａ）在溶液中进行测定样品和荧光标记化合物之间的反应，在时间ｔ↓［０］时，样品和标记化合物结合；　（ｂ）激发标记化合物中的荧光，其中标记物的性质和激发的性质是这样的：即，在 通过标记化合物和非荧光物质的反应改变所述荧光的波长发生所述的荧光；　（ｃ）随着反应进程检测所引起的荧光；　（ｄ）当所有的非荧光物质已经与标记化合物反应时，从所检测的荧光计算Ｆ↓［０］和Ｆ↓［∞］值，Ｆ↓［０］是在时间ｔ↓［０］时 的荧光，Ｆ↓［∞］是在时间ｔ↓［∞］时的荧光；　（ｅ）从Ｆ↓［０］和Ｆ↓［∞］值计算由于步骤（ａ）中反应的荧光中背景改变；　（ｆ）从所计算的值和适合的校准算法，确定非荧光物质与荧光标记化合物反应之前，在ｔ↓［０］时样品中存在的非 荧光物质的浓度。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：约翰菲利普维萨，安德鲁理查德格雷，
申请(专利权)人：商诊疗有限公司，
类型：发明
国别省市：GB[英国]