一种用亲和素化的荧光量子标记的免疫印迹定量检测蛋白的方法，属于免疫检测技术领域。本发明专利技术首先将待测蛋白跑电泳，跑完电泳的凝胶进行半干式ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ蛋白转移，将凝胶中的待测蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜ＰＶＤＦ上，然后对转移完的ＰＶＤＦ膜进行封闭，加抗待测蛋白的一抗反应，加生物素标记的二抗反应，再加入亲和素标记的荧光量子团进行反应，最后进行结果鉴定；本发明专利技术在传统免疫印迹分析的基础上引入亲和素化的荧光量子点，简化了操作步骤，灵敏度很高，利于进行微量目标蛋白的检测分析。本法将微量蛋白量的信号转化为光信号，再将光信号转化为数字信号，通过建立标准曲线，达到定量分析微量蛋白的目的。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及用亲和素化荧光量子团做标记的免疫印迹分析检测微量蛋白的 方法，特别强调了用亲和素化荧光量子团做标记时的高灵敏度及实验结果的可 保存性，属于免疫检测
技术介绍
免疫印迹法(Western blotting)是一种将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析 技术相结合的杂交技术。免疫印迹法具有分析容量大、敏感度高、特异性强等 优点，是检测蛋白质特性、表达与分布的一种最常用的方法，如组织抗原的定 性定量检测、多肽分子的质量测定及病毒的抗体或抗原检测等。但传统的免疫 印迹方法只能做定性或半定量分析，在做更深入的分析时受到一定限制，本发 明在传统免疫印迹方法的基础上引入CdTe (635nm)荧光量子点，把待测目标 蛋白量的信号转化为光信号，最后转化为数字信号，通过建立标准曲线，以达 到定量分析的目的。
技术实现思路
(一) 要解决的技术问题本专利技术旨在建立一个以CdTe荧光为信号的免疫印迹(western blotting)蛋 白分析方法。本专利技术利用量子点的荧光信号，提高免疫印迹分析方法的灵敏度、 准确度，建立标准曲线达到蛋白定量分析的目的。(二) 技术解决方案 ，首先将待测蛋白跑电泳，跑完电泳的凝胶进行半干式western blotting蛋白转移，将凝 胶中的待测蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜PVDF上，然后对转移完的PVDF膜进 行封闭，加抗待测蛋白的一抗反应，加生物素标记的二抗反应，再加入亲和素 标记的荧光量子团进行反应，最后进行结果鉴定； (一)亲和素化荧光量子团的制备(1) BSA变性将16.5mg BSA溶于lOmL双蒸水中，搅拌下加入0.42mg NaBH4,室温下 反应lh, 60-80。C下加热20min分解过量的NaBH4， BSA变性后成dBSA， 二硫 键打开成-SH，最终的dBSA水溶液的浓度为5xl0-5M;(2) dBSA的琥珀酰胺生物素化，即制备NHS-biotin-dBSA: 将琥珀酰胺生物素NHS-biotin按20mg/mL溶于二甲亚砜中，dBSA与丽S-biotin摩尔比1 : 30进行混合，搅拌反应2h，反应完成后紫外扫描进行鉴定；(3) 生物素化的dBSA包裹量子点 将dBSA和量子点分别按摩尔比1 : 1， 1 : 2， 1 : 4， 1 : 6混合，60-80。C水浴加热15min，室温下保持两天，使包裹完全，即为荧光量子团；(4) 亲和素化荧光量子团的制备 将亲和素与荧光量子团按摩尔比4 : 1反应lh， 4000r/min离心5min，去上清，用pH7.4PBS复溶沉淀即得亲和素标记的荧光量子团；(二)免疫印迹分析目标蛋白(1) SDS凝胶电泳 根据待测蛋白样品分子量选择合适的分离胶及浓縮胶浓度；配制相应浓度 的分离胶、浓縮胶，在恒压条件进行电泳；(2 ) western blotting转移蛋白 将凝胶电泳去除浓縮胶部分，于电极缓冲液中浸泡15min， PVDF膜与滤纸 切成凝胶一样大小，PVDF膜于电极缓冲液中浸泡至少5min，滤纸于电极缓冲 液中浸湿即可，按3层滤纸、凝胶、PVDF膜、3层滤纸叠放，置于半干式转印 槽中，以2mA/cm2，转移40min，即达到转移蛋白的目的；(3)蛋白质鉴定，即免疫检测 转移成功后的PVDF膜在37'C烘箱中干燥lh，取出后用甲醇浸泡数分钟， 超纯水洗净，加5%BSA+0.05%Tween对膜进行封闭，室温lh，用pH7.4 PBS 5min 洗涤3遍；加稀释1000倍的一抗3mL在室温下反应lh，用pH7.4 PBS 5min洗 净3遍；加稀释1000倍的生物素标记的二抗3mL室温反应lh，用pH7.4 PBS 5min 洗涤3遍；再加稀释1000倍的亲和素标记的荧光量子团3mL反应2h，用pH7.4 PBS5min洗净3遍；洗涤后用荧光成像仪进行检测；待测蛋白量越多，所得荧 光值越高；标准曲线的建立将己知蛋白含量的待测样品的标准品配成由高到低6个 浓度，进行(一)、(二)步骤的反应，根据荧光成像仪测定结果，以标准蛋白质量 为横坐标，以所测荧光强度为纵坐标，绘制标准曲线。所用的量子点是指能够发射荧光的纳米粒子，即发光微粒，购于博阳生物 科技(上海)有限公司。所述的SDS凝胶电泳待测蛋白样品为蛋白A,配制质量浓度10%的分离 胶、质量浓度5%的浓縮胶，在恒压条件进行电泳先80V电压下跑至浓縮胶与 分离胶界面，然后100V电压下跑完。所说的电泳凝胶进行半干式western blotting蛋白转移是在半干式western blotting转印槽中利用电流作用将凝胶中的蛋白转移至PVDF膜上，以便做进一 步分析。所说的PVDF膜的封闭是将PVDF上未结合蛋白的位点进行封闭，以保证 在后续免疫反应中一抗、二抗与待测蛋白的特异性结合，避免其非特异性地吸 附到PVDF膜上，以至背景值过高。所说的加一抗、二抗反应是指加入待测目标蛋白特异的多克隆抗体，二抗 是生物素化的羊抗兔抗体。所说的结果鉴定是最后加入亲和素化的荧光量子团，反应后用荧光凝胶成 像仪进行检测分析。 (三)有益效果(1) 本专利技术在传统免疫印迹分析的基础上引入亲和素化的荧光量子点，简 化了操作步骤，灵敏度很高，利于进行微量目标蛋白的检测分析。(2) 本法突破了免疫印迹方法半定量分析的局限，将微量蛋白量的信号转 化为光信号，再将光信号转化为数字信号，通过建立标准曲线，达到定量分析 微量蛋白的目的。(3) 量子点的光信号在一定溶液中可以长时间保存。(4) 对于珍贵的蛋白样品，本法还适用于进行重复检测。 附图说明图l变形BSA (dBSA)的生物素化。1.琥珀酰胺生物素，2.变性BSA，3. 生物素化dBSA。图2生物素化的dBSA包裹量子点。l.标准蛋白；2.量子点；3.变性BSA;4. 变性BSA-量子点(摩尔比6 : 1); 5.变性BSA-量子点(摩尔比4 : 1);6.变 性BSA-量子点(摩尔比2 : 1); 7.变性BSA-量子点(摩尔比1 : 1)。图3生物素化的dBSA包裹量子点荧光扫描图。图中数值为变性BSA与 量子点摩尔比值。图4 protein A的荧光免疫分析标准曲线 具体实施方法(一)亲和素化荧光量子团的制备(1) BSA变性将16.5mgBSA溶于lOmL双蒸水中，搅拌下加入0.42mgNaBH4,室温下反 应lh,60-8(TC下加热20min，分解过量的NaBHp BSA变性，二硫键打开成-SH， 最终的dBSA水溶液的浓度为5xl0_5M。(2) dBSA的琥珀酰胺生物素化(NHS-biotin-dBSA的制备) 将琥珀酰胺生物素(NHS-biotin)按20mg/mL溶于二甲亚砜中，dBSA与NHS-biotin摩尔比1 : 30进行混合，搅拌反应2h，反应完成后紫外扫描进行鉴 定。(3) 生物素化的变性BSA包裹量子点将dBSA和量子点按一定的摩尔比(l : 1， 1 : 2， 1 : 4， 1 : 6)混合，60-80°C 水浴加热15min，室温下保持两天，使包裹完全。 用SDS-PAGE荧光扫描鉴定包裹结果。 SDS-PAGE条件10°/。分离胶，4%浓縮胶，电压120V。(4)亲和素化荧光量子团的制备 将亲本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用亲和素化的荧光量子标记的免疫印迹定量检测蛋白的方法，其特征是首先将待测蛋白跑电泳，跑完电泳的凝胶进行半干式ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ蛋白转移，将凝胶中的待测蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜ＰＶＤＦ上，然后对转移完的ＰＶＤＦ膜进行封闭， 加抗待测蛋白的一抗反应，加生物素标记的二抗反应，再加入亲和素标记的荧光量子团进行反应，最后进行结果鉴定； （一）亲和素化荧光量子团的制备 （１）ＢＳＡ变性： 将１６．５ｍｇ ＢＳＡ溶于１０ｍＬ双蒸水中，搅拌下加入０．４２ ｍｇ ＮａＢＨ↓［４］，室温下反应１ｈ，６０－８０℃下加热２０ｍｉｎ分解过量的ＮａＢＨ↓［４］，ＢＳＡ变性后成ｄＢＳＡ，二硫键打开成－ＳＨ，最终的ｄＢＳＡ水溶液的浓度为５×１０↑［－５］Ｍ； （２）ｄＢＳＡ的琥珀酰胺生物素化，即制备 ＮＨＳ－ｂｉｏｔｉｎ－ｄＢＳＡ： 将琥珀酰胺生物素ＮＨＳ－ｂｉｏｔｉｎ按２０ｍｇ／ｍＬ溶于二甲亚砜中，ｄＢＳＡ与ＮＨＳ－ｂｉｏｔｉｎ摩尔比１∶３０进行混合，搅拌反应２ｈ，反应完成后紫外扫描进行鉴定； （３）生物素化的ｄＢＳＡ包裹 量子点： 将ｄＢＳＡ和量子点分别按摩尔比１∶１，１∶２，１∶４，１∶６混合，６０－８０℃水浴加热１５ｍｉｎ，室温下保持两天，使包裹完全，即为荧光量子团； （４）亲和素化荧光量子团的制备： 将亲和素与荧光量子团按摩尔比４∶１ 反应１ｈ，４０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，去上清，用ｐＨ７．４ＰＢＳ复溶沉淀即得亲和素标记的荧光量子团； （二）免疫印迹分析目标蛋白 （１）ＳＤＳ凝胶电泳： 根据待测蛋白样品分子量选择合适的分离胶及浓缩胶浓度；配制相应浓度 的分离胶、浓缩胶，在恒压条件进行电泳； （２）ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ转移蛋白： 将凝胶电泳去除浓缩胶部分，于电极缓冲液中浸泡１５ｍｉｎ，ＰＶＤＦ膜与滤纸切成凝胶一样大小，ＰＶＤＦ膜于电极缓冲液中浸泡至少５ｍｉｎ，滤纸 于电极缓冲液中浸湿即可，按３层滤纸、凝胶、ＰＶＤＦ膜、３层滤纸叠放，置于半干式转印槽中，以２ｍＡ／ｃｍ↑［２］，转移４０ｍｉｎ，即达到转移蛋白的目的； （３）蛋白质鉴定，即免疫检测： 转移成功后的ＰＶＤＦ膜在３７℃烘箱中干燥１ｈ ，取出后用甲醇浸泡数分钟，超纯水洗净，加５％ＢＳＡ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ对膜进行封闭，室温１ｈ，用ｐＨ７．４ ＰＢＳ ５ｍｉｎ...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：胥传来，许定花，金征宇，彭池方，刘丽强，陈伟，袁媛，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]
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