重组人胱抑素C基因及其表达与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种重组人胱抑素Ｃ基因及其表达与应用。该截短人胱抑素Ｃ基因具有ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１所示核酸序列；截短人胱抑素Ｃ蛋白具有ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２所示氨基酸序列。本发明专利技术运用基因工程技术表达纯化大量稳定的重组可溶胱抑素Ｃ蛋白并利用该蛋白获得了一对单抗，进而制备了稳定的胱抑素Ｃ诊断试剂及其质控品。解决了我国人胱抑素测定试剂盒自主研发的瓶颈问题。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体地，涉及一种重组人胱抑素c基 因及其表达与应用。
技术介绍
胱抑素C(Cystatin C)是半胱氨酸蛋白酶抑制剂超家族2中的成 员之一。它的分子量为13kD，是由122个氨基酸组成的低分子量非 糖基化蛋白质(M Abrahamson， et al. Biochemical Journal, 1990.)， 含两对二硫键，且能在所有有核细胞中恒定、持续地转录及表达，可 被看做House ke印ing基因(黄君富等，医学临床生物化学与检验 学分册)。近来的研究已经发现胱抑素C参与机体许多生理与病理过 程，包括肿瘤的侵润性生长及转移、炎症的发生与发展以及组织纤维 化(张耀全，袁发焕等，2003,23(6))等疾病。作为外分泌型蛋白， 它广泛的存在于脑脊液、血液、唾液及精液等体液中且浓度较高。因 胱抑素C是一种低分子量蛋白质，可经肾小球自由滤过，在近曲小管 被重吸收并降解，肾脏是清除循环中胱抑素C的唯一器官，所以血清 胱抑素C浓度主要由GFR决定，由此可见胱抑素C是一种理想的反映 GFR变化的内源性标志物(GrubbA， et al， Acta Med Scand， 1985)。 同时有研究报道应用兔抗胱抑素C抗体建立的ELISA技术检测了急性 心肌梗塞病人急性期、恢复期及正常对照组的血清胱抑素C水平，发 现急性期与恢复期的自身对照并无显著性差异，但有意义的是这两者的胱抑素C水平均显著低于正常对照组(冯建芳等，基础医学与临床，1995)。提示胱抑素C的血清浓度改变，在一定程度上可以作为 急性心肌梗塞诊断的参考指标。血清胱抑素C浓度的测定具有重要的诊断意义，但目前我国还没 有自主研发的胱抑素C诊断试剂。究其原因制备胱抑素C诊断试剂盒 需要特异性强和灵敏性高的抗胱抑素C单克隆抗体,而要得到该单克 隆抗体就必须得到高纯度的胱抑素C蛋白，传统的从胎盘、尿液等组 织中提取的胱抑素C蛋白浓度低，纯度差，批间差大无法用做免疫 原制备单抗或制备诊断质控品。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种重组人胱抑素c基因、该基因表达的重组蛋白及其制备方法，以及该蛋白的应用。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案是 一种具有SEQ ID NO : 1所示核酸序列的截短人胱抑素C基因。一种具有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的截短人胱抑素C蛋白。 一种根据SEQ ID NO :1所示核酸序列制备重组可溶人胱抑素C 蛋白的方法，包括下述步骤(1)从新鲜人胎盘中获得总RNA，用 RT-PCR方法得到截短人胱抑素C的DNA序列；(2)用步骤(1)获得 的DNA序列与表达质粒重组，重组子经过DNA测序验证，确定重组表 达质粒的序列和阅读框均正确；(3)用步骤(2)所获得的重组表达 质粒转化表达宿主细胞；(4)培养宿主细胞并从细胞胞质中回收和纯 化重组可溶性人胱抑素C蛋白。所述表达载体为能与人胱抑素蛋白的基因序列重组并形成表达 质粒的表达载体，具体地，表达载体为原核表达载体，且该原核表达 载体的融合蛋白标签可对人胱抑素C蛋白的两对二硫键正确配对起到促进作用，该原核表达载体可选PET32a(+)。所述的表达宿主细胞 为能够表达所述重组表达质粒的宿主细胞，且具有校正大肠杆菌密码 子偏好性的特征，可选大肠杆菌Rosseta gami II (DE3)。本专利技术不限于特定的表达载体，在一优选实施方案中，本专利技术使 用原核表达载体，例如PET32a(+)。本专利技术不限于特定的宿主细胞， 在一优选实施方案中，本专利技术使用大肠杆菌Rosseta gami II (DE3)， Rosseta gami II (DE3)购于Merck公司，是MerK公司自己对有特殊 功能的大肠杆菌产品的命名。所述培养宿主细胞所用的培养基采用含抗生素基础培养基扩增 培养宿主细胞，参数为培养温度35。C 37T:，培养时间4 5h;诱 导温度35-37°C ，诱导时间3 5h;诱导物IPTG终浓度为0. 2 0。 5mM。筛选宿主细胞中高效表达的阳性表达菌株作为工程菌，重组可溶 性人胱抑素C蛋白通过工程菌诱导培养后离心收集菌体，超声破碎后 离心取上清经过镍柱一步纯化得到。一种制备抗人胱抑素C不同表位的系列单克隆抗体或多克隆抗 体的方法，运用按照上述方法制备的重组可溶性人胱抑素C蛋白免疫 实验动物获得单克隆抗体或多克隆抗体。通过位点叠加实验确定抗不 同抗原表位的系列单克隆抗体；所述系列是指大于等于两株。一种制备测定人体内人胱抑素C蛋白浓度诊断试剂的方法，运用上述方法制备的两株单克隆抗体通过化学交联剂分别与胶乳交联后 混合于缓冲液中制备成诊断试剂，其中两株单克隆抗体摩尔比为1:所述化学交联剂为Sulfo-NHS， EDC. HCL。一种制备人胱抑素C诊断试剂质控品的方法，按照上述方法制备 的重组可溶性人胱抑素C蛋白用保护性缓冲液分别调制到从低到高5 个固定浓度后冻干制备。所述从低到高5个固定浓度是指按照上述制备的诊断试剂的检 测线性范围而定的浓度。所述的5个固定浓度分别为0。 5ug/ml; lug/ml; 2ug/ml; 4ug/ml; 8ug/ml综上，本专利技术的有益效果是本专利技术运用基因工程技术表达纯化 大量稳定的重组可溶胱抑素C蛋白并利用该蛋白获得了一对单抗，进 而制备了稳定的胱抑素C诊断试剂及其质控品。解决了我国人胱抑素 测定试剂盒自主研发的瓶颈问题。 附图说明图1是本专利技术制备的人胱抑素c诊断试剂的测定结果示意图，其中横轴表示进口试剂1测定进口试剂2校准品的校准值(ug/ml)，纵轴表示自制试剂测定进口试剂2校准品的校准值(ug/ml);图2是重组人胱抑素C蛋白诱导纯化电泳图，其中，M:中分子量蛋白Marker; 1: IPTG诱导前全菌裂解液；2: IPTG诱导3h后全菌裂解液；3: Ni柱纯化后重组蛋白；图3是cystatin C重组蛋白Weastern Blot分析的示意图，其 中，M:预染蛋白Marker;l: cystatin C重组蛋白， 一抗为抗人胱抑 素多抗；2: cystatin C重组蛋白，一抗为抗人血红蛋白多抗。 具体实施例方式实施例1:制备重组可溶人胱抑素C蛋白(1) 克隆截短胱抑素C基因、构建表达质粒按照胱抑素C基因DNA序列设计引物，RT-PCR扩增该基因并与 pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5 a ， PCR鉴定单克隆确定可能 的阳性质粒，再提取质粒双酶切鉴定。经过DNA测序证明碱基及开放 阅读框正确的阳性质粒用适宜的酶切出与同样双酶切的PET32a (+)连 接，构建原核表达质粒，转化表达宿主菌Rosseta gami II 。 PCR鉴 定阳性宿主菌。上述实验用质粒载体均为本实验室保存，表达菌 Rosseta gami II购于Merck公司，总RNA提取试剂盒购于Fermentas 公司，反转录试剂盒、限制性内切酶、连接试剂盒购于大连Takara 公司。(2) 筛选高效表达的阳性表达菌株接种10株上述阳性菌株与5mlLB+amp中，37°C， 220rpm培养 过夜，第二日按l^接种量接种于新鲜的LB+amp培养基中，37°C， 220rpm培养4一5小时，取lml菌液做未诱导条件下的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１所示核酸序列的截短人胱抑素Ｃ基因。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：喻堃，王保宁，周文娟，吴丹，陈丹，
申请(专利权)人：四川省迈克科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：90[中国|成都]