本发明专利技术涉及一种双抗体夹心免疫吸附试验来定量检测组氨酸标签蛋白或含组氨酸标签的融合蛋白的方法，其定量检测方法是：它利用在制备抗标签蛋白多克隆抗体的基础上，经过与多聚组氨酸单克隆抗体及相应酶标抗抗体的浓度配伍试验，建立双抗体夹心酶联免疫吸附方法，来定量检测组氨酸标签蛋白或含组氨酸标签的融合蛋白。此方法不仅可以定量检测，而且适用范围广、特异性强、灵敏度高、重复性好、非常适合于快速定量检测组氨酸标签蛋白或含组氨酸标签的融合蛋白。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种利用双抗体夹心酶联免疫吸附试验来定量检测组氨酸标签蛋白或 含组氨酸标签的融合蛋白的方法。
技术介绍
在蛋白质组学的研究领域中，组氨酸标签蛋白是最常见的一种蛋白。因为大量的试 验表明，在蛋白质结构末端中加入多聚组氨酸序列，可以易于目的蛋白的检测和纯化， 并能帮助目的蛋白保留天然构象及与配体结合的能力。目前对组氨酸标签蛋白或含组氨 酸标签的融合蛋白的检测方法主要是免疫印迹法，它操作复杂耗时、所用试剂较贵，并 且只是一种定性的方法。
技术实现思路
为了克服免疫印迹法的不足，本专利技术提供一种组氨酸标签蛋白或含组氨酸标签的融 合蛋白的定量检测方法。它不仅可以定量检测，而且适用范围广、特异性强、灵敏度高、 重复性好、非常适合于快速定量检测组氨酸标签蛋白或含组氨酸标签的融合蛋白。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是提供一种组氨酸标签蛋白或含组氨酸标签的融合蛋白的定量检测方法，其特征是它利用在制备抗标签蛋白多克隆抗体的基 础上，经过与多聚组氨酸单克隆抗体及相应酶标抗抗体的浓度配伍试验，建立双抗体夹 心酶联免疫吸附方法来定量检测组氨酸标签蛋白或含组氨酸标签的融合蛋白。所述的定量检测方法包括抗组氨酸标签蛋白的多克隆抗体的制备、抗体间的浓度 配伍试验及双抗体夹心酶联免疫吸附试验的建立。所述的抗组氨酸标签蛋白多克隆抗体的制备方法是分别用不同的组氨酸标签蛋白 作为免疫原，采用肌肉，皮下，淋巴结混合注射弗氏佐剂全程免疫的方法免疫雄性成年 新西兰白兔；第一次免疫前一周，注射弗氏完全佐剂于右后足垫，促使腹股沟淋巴结肿 大，加强免疫效果；第一次免疫加弗氏完全佐剂，l-3mg免疫原/只；1周后第二次免 疫加弗氏不完全佐剂，l-3mg免疫原/只；l周后第三次免疫直接注射免疫原溶液，l-3mg免疫原/只；l周后第四次免疫直接注射免疫原溶液，l-3mg免疫原/只；1周后最后一次免疫直接注射免疫原溶液，l-3mg免疫原/只；l周后兔颈动脉取血，用改进的琼脂双向扩散法测定免疫兔血清的效价，观测沉淀线的形成，推断血清中抗体的滴度，选择血清效价最高的一组抗血清，用A蛋白亲和层析法纯化抗体。方法充分混匀ProteinA树脂浆后，将lml树脂浆填入层析柱内。用4-8倍体积的Binding Buffer A (Na2HP0420mM， NaCl 0.15M, PH7.0 )冲洗出树脂保护液。然后用2-4倍于柱床体积的Buffer A平衡柱子，直到洗出液与Buffer A pH相同。然后将lml血清用Buffer A稀释后缓缓注入层析柱，同时收集流出液。用4-8倍体积的Buffer A洗脱杂蛋白，收集洗脱液。用4-8倍体积的Elution Buffer B ( Citric acid O.IM， PH3.0 )洗脱吸附于柱上的IgG，同时分管收集样品，每管lml。收集完毕后立刻使用Buffer B冲洗柱床，至流出液pH到2-5，再使用Buffer A冲洗至流出液pH为5-7，并保留部分液体，平衡和保护填料，以待下次使用。然后用Bradford法和SDS-PAGE电泳分别测定和检测每管抗体的浓度和纯度，选择电泳结果无杂带的高纯抗体进行浓度配伍试验。所述的抗体间的浓度配伍试验是，采用商品化的多聚组氨酸单克隆抗体作为包被抗体，通过棋盘滴定法与制备得到的抗组氨酸标签蛋白多克隆抗体及相应酶标抗抗体进行不同浓度梯度的阵列配对，找出最好的配对条件，建立双抗体夹心酶联免疫吸附试验的系统。所述的最好条件的配对抗体的挑选方法是选择信噪比最低，即检测范围内最高浓度 的组氨酸标签蛋白的光吸收值最高，且组氨酸标签蛋白浓度为零时光吸收值最低的条 件。所述的双抗体夹心酶联免疫吸附试验的方法是在按照上述方法确立了最优的抗体 浓度配伍条件之后，应用最优的多聚组氨酸单克隆抗体(包被抗体)浓度、抗组氨酸标 签蛋白多克隆抗体浓度及相应酶标二抗浓度进行如下操作用多聚组氨酸单克隆抗体包 被96孔板，18-24小时后含牛血清白蛋白的缓冲液封闭96孔板，孵育及洗涤后加入待 测标本和倍比稀释的相应组氨酸标签蛋白标准品，再次孵育及洗涤后加入抗组氨酸标签 蛋白多克隆抗体，依然是孵育及洗涤后加入相应酶标抗体，最后一次孵育及洗涤后以 3,3'，5,5'——四甲基联苯胺底物显色，于波长450nm测定光吸收值。以标准品的光吸收 值为纵坐标，相应浓度为横坐标，作标准曲线，根据待测样本的光吸收值，经曲线拟合 或换算，得出待测标本中相应的组氨酸标签蛋白或含组氨酸标签的融合蛋白的浓度。本专利技术的有益效果是，它可以定量检测组氨酸标签蛋白或含组氨酸标签的融合蛋白，而且所需制备抗体的方法简单易行，因为包被抗体可直接选用商品化的多聚组氨酸 单克隆抗体而无需进行单克隆抗体的制备及特异性检测试验。而单克隆抗体与多克隆抗 体结合的夹心酶联免疫法依然具有适用范围广、特异性强、灵敏度高、重复性好的特点。 与传统的免疫印迹法需耗时2円相比，本方法除包被抗体过夜外，其余歩骤仅需数小时 完成，省时方便。具体实施例方式抗组氨酸标签蛋白多克隆抗体的制备是分别用不同的组氨酸标签蛋白作为免疫原 免疫动物。第一次免疫前一周，注射弗氏完全佐剂于右后足垫，促使腹股沟淋巴结肿大， 加强免疫效果；第一次免疫加弗氏完全佐剂，l-3mg免疫原/只；1周后第二次免疫 加弗氏不完全佐剂，l-3mg免疫原/只；l周后第三次免疫直接注射免疫原溶液，l-3mg 免疫原/只；l周后第四次免疫直接注射免疫原溶液，l-3mg免疫原/只；l周后最后一 次免疫直接注射免疫原溶液，l-3mg免疫原/只；l周后兔颈动脉取血，用改进的琼脂双向扩散法测定免疫兔血清的效价，观测沉淀线的形成，推断血清中抗体的滴度。抗体间的浓度配伍试验是，采用商品化的多聚组氨酸单克隆抗体作为包被抗体，通 过棋盘滴定法与制备得到的抗组氨酸标签蛋白多克隆抗体及相应酶标抗抗体进行不同 浓度梯度的阵列配对，找出最好的配对条件，建立双抗体夹心酶联免疫吸附试验的系统。 最好条件的配对抗体的挑选方法是选择信噪比最低，即检测范围内最高浓度的组氨酸标 签蛋白的光吸收值最高，且组氨酸标签蛋白浓度为零时光吸收值最低的条件。实施例l定量检测重组人血管内皮抑制素(恩度)的方法重组人血管内皮抑制素注射液(恩度)2006年由SFDA批准上市(国药准字 S20050088)，成为第一个具有中国自主知识产权的抗肿瘤生物药物。恩度是在内源性人 血管内皮抑制素Endostatin的N端加入了 9个氨基酸构建得到的一个重组蛋白。恩度的 氨基酸序列如下MGGSHHHHHHSHRDFQPVLHLVALNSPLSGGMRGIRGADFQCFQQARAVGLAQSAASCHHAYIVLC正NSFMTASK。可以看出，恩度的序列中有6个连续的组氨酸，构 成了组氨酸标签的结构，因此可用此方法进行检测。将恩度注射液作为免疫原，采用肌肉，皮下，淋巴结混合注射弗氏佐剂全程免疫的方法免疫雄性成年新西兰白兔；第一次免疫前一周，注射弗氏完全佐剂于右后足垫，促使腹股沟淋巴结肿大，加强免疫效果；第一次免疫加弗氏完全佐剂，l-3mg免疫原/只；l周后第二次免疫加弗氏不完全佐剂，l-3mg免疫原/只；1周后第三次免疫直接注射免疫原溶液，l-3mg免疫原/只；l周后第四本文档来自技高网...
【技术保护点】
组氨酸标签蛋白或含组氨酸标签的融合蛋白的定量检测方法，其特征在于：它利用在制备抗组氨酸标签蛋白多克隆抗体的基础上，经过与多聚组氨酸单克隆抗体及相应酶标抗抗体的浓度配伍试验，建立双抗体夹心酶联免疫吸附方法来定量检测组氨酸标签蛋白或含组氨酸标签的融合蛋白。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈亚利，张韫，宋诗雨，
申请(专利权)人：江苏先声药物研究有限公司，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]
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