血清中微小核糖核酸的检测方法和用于检测的试剂盒、生物芯片及其制作和应用方法技术

本发明专利技术涉及血清中微小核糖核酸分子的检测方法、用于检测血清中微小核糖核酸的试剂盒或生物芯片以及试剂盒和生物芯片的制作和应用方法，目的在于检测血清微小核糖核酸的变化，得到在疾病及正常生理状态下差异表达程度大的一类血清微小核糖核酸探针，应用于疾病鉴定和病程，恶性疾病复发率及预后和药效的诊断相关的ＰＣＲ试剂盒和生物芯片，以提高疾病的早期发现率以及确诊的准确性和疗效。本发明专利技术的技术方案为：血清中微小核糖核酸分子的检测方法：收集血清样本；将１０μｌ血清作为ｂｕｆｆｅｒ进行逆转录反应，来制备ｃＤＮＡ样品；用人全部五百多个成熟体微小核糖核酸设计引物进行ＰＣＲ反应；进行ＰＣＲ产物的琼脂糖凝胶电泳；ＥＢ染色后在紫外灯下观察结果。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及人和动物血清中微小核糖核酸分子的 检测方法、用于检测血清中微小核糖核酸的试剂盒或生物芯片以及试剂盒和生 物芯片的制作和应用方法。
技术介绍
微小核糖核酸，英文名为microRNA，简写作raiRNA，是一类长约19至23个核 苷酸的非编码单链小核糖核酸分子，它们在进化上高度保守，广泛存在于动植 物细胞中，近五年来在人类、小鼠、大鼠等多种生物物种中鉴别出数百种微小 核糖核酸分子。微小核糖核酸通过识别靶mRNA的3'端非翻译序列，与之不完全 互补，从而抑制靶mRNA的翻译。其序列、结构、丰度和表达方式的多样性使微 小核糖核酸成为信使RNA强有力的调节因子并在基因表达调控领域中起着超乎 想象的重要作用。微小核糖核酸与动物的许多正常生理活动密切相关，涉及生物个体发育； 组织分化；细胞调亡以及能量代谢等生命活动的方方面面。同时，微小核糖核 酸也与许多疾病的发生及发展存在千丝万缕的联系，在发生某种疾病时总有一 些微小核糖核酸表达量是上调的， 一些是下调的。微小核糖核酸与疾病的关联 有两个层面首先，微小核糖核酸的变化可能是病因，这是因为疾病的抑制因 子以及促进因子都有可能是微小核糖核酸的靶位点，当微小核糖核酸本身先发 生了紊乱表达，比如本来抑制疾病促进因子的微小核糖核酸表达量降低了，或 者抑制疾病抑制因子的微小核糖核酸表达量升高了，其最终结果都会导致下游 一系列基因表达的变化以及某些通路的整体紊乱，进而诱发疾病发生；其次， 微小核糖核酸的变化也可以是疾病的结果，这是因为当疾病(如癌症)发生时， 会导致染色体片段的丢失、基因的突变或者染色体片段的剧烈扩增，若微小核 糖核酸正好位于这一变化区段内，那么其表达量将发生极其显著的变化。最近研究发现慢性淋巴细胞性白血病以及Burkitt淋巴瘤中几种微小核糖 核酸的表达水平均有不同程度的下调；分析比较人肺癌、乳腺癌组织中微小核糖 核酸表达时发现有若干组织特定的微小核糖核酸的表达水平相对于正常组织发 生了变化。也有研究证明微小核糖核酸影响了心肌肥厚、心衰、动脉粥样硬化等 心血管疾病的发生和发展并且与二型糖尿病等代谢性疾病有密切关联。这些结果 提示微小核糖核酸表达与疾病发生和发展之间存在必然联系。微小核糖核酸完全 可以作为一类新的疾病标志物，相比于传统的病理切片或单一使用的生化指标等 手段，能更加准确帮助疾病定性，诊断疾病的发展阶段，判断并发症的发生和恶 性疾病复发率及疾病的预后，并诊断药效和疗效。此外，微小核糖核酸还是潜在 的药物靶点，如果抑制疾病过程中上调的微小核糖核酸和过表达下调的微小核糖 核酸，将有可能极大地缓解疾病的发生和发展。然而，因为人和动物微小核糖核 酸的研究工作才开展4年左右，目前还没有相关的微小核糖核酸试剂盒。因此， 需要我们更深入研究肿瘤，各种急慢性传染病和急慢性疾病(如呼吸系统疾病， 免疫系统疾病，心血管系统疾病，内分泌系统疾病等)过程中微小核糖核酸的特 异变化，对微小核糖核酸的进一步探索将为我们提供疾病诊疗新途径。微小核糖 核酸试剂盒的研发和在临床医学的应用将具产生巨大经济效益和社会前景。
技术实现思路
本专利技术需要解决的问题是通过研究各种肿瘤，各种急慢性传染病(如病毒性 肝炎，艾次滋病等)和急慢性疾病(如呼吸系统疾病，免疫系统疾病，心血管系 统疾病，内分泌系统疾病等)过程中血清微小核糖核酸的特异变化，得到在疾病 及正常生理状态下差异表达程度大的一类血清微小核糖核酸探针，应用于疾病鉴 定和病程，恶性疾病复发率及预后和药效的诊断相关的PCR试剂盒和生物芯片， 以提高疾病的早期发现率以及确诊的准确性和疗效。实现本专利技术目的的一种技术方案为 血清中微小核糖核酸分子的检测方法1) 收集血清样本；2) 将10 u 1血清作为buffer进行逆转录反应，来制备cDNA样品；3) 用人全部五百多个成熟体微小核糖核酸设计引物进行PCR反应；4) 进行PCR产物的琼脂糖凝胶电泳；5) EB染色后在紫外灯下观察结果。所述步骤5)之后还包括下列步骤用荧光染料EVA GREEN检测并比较血清 样本相对于正常血清中微小核糖核酸的量的变化。实现本专利技术目的的另一种技术方案为血清中微小核糖核酸分子的检测方法1、 使用Trizol试剂(Invitrogen公司)提取血清总RNA (10ml血清通常能富集 约10ug左右的RNA);2、 通过RNA逆转录反应得到cDNA;3、 用人全部五百多个成熟体微小核糖核酸设计引物进行PCR反应；4、 进行PCR产物的琼脂糖凝胶电泳；5、 EB染色后在紫外灯下观察结果。所述步骤5之后还包括下列步骤用荧光染料EVA GREEN检测并比较血清样 本相对于正常血清中微小核糖核酸的量的变化。在上述检测方法中，我们首次使用了 RT-PCR技术来发现并证明人和动物血 清中能检测到各种微小核糖核酸，而且它们具有不同的组织来源和表达丰度。 其次，为了研究在各种肿瘤，各种急慢性传染病(如病毒性肝炎，艾次滋病等) 和急慢性疾病(如呼吸系统疾病，免疫系统疾病，心血管系统疾病，内分泌系统 疾病等)过程中血清微小核糖核酸的特异变化，我们选取再生障碍性贫血、乳腺 癌、骨肉瘤、中枢神经系统淋巴瘤、糖尿病病人血清样品，同时用人全部五百多 个成熟体微小核糖核酸设计引物进行了血清微小核糖核酸的定量PCR实验，以得 到与疾病相关的差异表达的一类血清微小核糖核酸探针。我们直接用病人血清进 行定量PCR实验，用荧光染料EVA GREEN检测并比较相对于正常血清各种疾病血 清中微小核糖核酸的量的变化。一种用于血清中微小核糖核酸检测的生物芯片，包括人血清中能正常检测到 的全部微小核糖核酸的探针。此芯片能高通量地筛选血清中稳定变化的微小核糖核酸探针，同时通过血清 中微小核糖核酸的整体变化预测和诊断疾病。最后我们通过定量PCR技术和生物芯片技术筛选得到和再生障碍性贫血、乳腺癌、骨肉瘤、中枢神经系统淋巴瘤、糖尿病等疾病相关的血清微小核糖核酸， 作为预测疾病以及诊断病变程度的探针，来制备PCR试剂盒。一种用于血清中微小核糖核酸检测的试剂盒，包括一批血清微小核糖核酸探 针以及Taq酶、dNTP试剂。目前对疾病进行临床诊断的生物化学及分子生物学手段还比较繁琐和粗糙， 比如对于癌症的诊断，需要将手术标本进行组织细胞学染色检验，过程复杂又耗 时耗力。此外，目前尚没有一套早期预测及诊断重症疾病的简易又精确的方法。 鉴于目前疾病诊断方法的单一以及早期发现与预测的困难，我们亟待找到一种比 目前现有方法都更简单可靠同时又简单易行的新方法来鉴定疾病的发生以及判 断病理阶段。我们选取血清中的微小核糖核酸作为研究对象，希望通过检测血清 中的微小核糖核酸解决临床早期诊断等问题。检测血清中的微小核糖核酸有以下 几个优势首先，血清相对组织较易获得，甚至在平常体检中都可以收集到；其 次，血清中的微小核糖核酸反映的是整个机体的生理病理情况，其检测结果具有 指导意义；第三，血清中某些特定的微小核糖核酸可以指示特定的组织器官的病 变，因此其又可以作为疾病诊断的一个参数。总之，检测血清中的微小核糖核酸， 简单易行且效果优越，从血清中的微小核糖核酸的特异性变化这一新角度出发发 现疾病并且区分程度，将建立一种本文档来自技高网...

【技术保护点】
血清中微小核糖核酸分子的检测方法，其特征是，所述检测方法包括下列步骤：　６）收集血清样本；　７）将１０μｌ血清作为ｂｕｆｆｅｒ进行逆转录反应，来制备ｃＤＮＡ样品；　８）用人全部五百多个成熟体微小核糖核酸设计引物进行ＰＣＲ反 应；　９）进行ＰＣＲ产物的琼脂糖凝胶电泳；　１０）ＥＢ染色后在紫外灯下观察结果。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张辰宇，张峻峰，陈熹，巴一，陈江宁，王可慧，殷媛，蔡星，张燕，张红杰，曾柯，王进，郭继刚，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]