核糖核苷酸还原酶M1基因检测试剂盒制造技术

一种核糖核苷酸还原酶Ｍ１基因检测试剂盒，由盒体１、衬垫２，染料法ＰＣＲ反应液３、Ｔａｑ酶４、标准品５、阴性对照６、阳性对照７组成，衬垫２上设有容器孔，分别放置染料法ＰＣＲ反应液３、Ｔａｑ酶４、标准品５、阴性对照６、阳性对照７。本实用新型专利技术通过优化ＰＣＲ的引物、ＳＹＢＲ　　ＧｒｅｅｎＩ荧光染料和ＰＣＲ的条件，避免了ＳＹＢＲ　　ＧｒｅｅｎＩ荧光染料的缺陷，非特异性的扩增，本试剂盒不仅保持了ＰＣＲ的高灵敏性，而且使得被检测基因的特异性大大提高。本实用新型专利技术设计合理，与现有探针法相比较，不需要设计荧光探针，使用方便而且成本低。（*该技术在2017年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本技术属生物
，涉及核糖核苷酸还原酶Ml基因检测试剂盒， 是通过利用SYBR GREEN I荧光定量PCR，检测肿瘤组织中吉西他滨抗癌药 敏感性相关基因，核糖核苷酸还原酶M1亚单位(RRM1)基因mRNA表达水 平的试剂盒。 技术背景核糖核苷酸还原酶(ribonucleotide reductase ,RR)是DNA合成通路中的限 速酶,它能逆转二磷酸核苷酸为二磷酸脱氧核苷酸，后者是DNA合成和修复必 不可少的。RR包括2个亚单位:M1和M2 。 Ml亚单位控制底物的特异性和 整个酶的活性;M2亚单位携带接触抑制区,控制底物转化。RRM1基因被认为 是一种抑癌基因,能抑制肿瘤转移，定位于染色体Uql5. 5区域着丝粒部分，该 区域称为LOHllA, 75 y。的NSCLC患者有异质性缺失，这种异质性缺失与患者 预后差成正比。吉西他滨是嘧啶类抗代谢药物，主要作用于DNA合成期(S期)，也可阻止 Gl期向S期进展,是细胞周期特异性药物。吉西他滨作为一种前药在细胞内是 脱氧胸苷激酶磷酸化的良好底物,在酶的作用下转化成吉西他滨一磷酸盐、吉西 他滨二磷酸盐、吉西他滨三磷酸盐，其中吉西他滨二磷酸盐、吉西他滨三磷酸盐 为活性产物。吉西他滨三磷酸盐插入DNA链后,可抑制DNA聚合,进而抑制 DNA合成和修复;吉西他滨二磷酸盐可抑制核糖核苷酸还原酶,从而减少了 DNA合成和修复所需的脱氧核苷酸的量,使DNA合成发生障碍。当RRM1表 达过高,则会干扰吉西他滨的代谢,产生耐药。在一些回顾性研究中发现，RRM1 与吉西他滨耐药密切相关,接受过吉西他滨和顺铂联合治疗的NSCLC患者，体 内低RRM1 mRNA水平与生存时间成正比。免疫组化是检测组织标本中RRM1蛋白表达常用的方法，但大多数肿瘤患 者是晚期，失去了手术机会，大快肿瘤组织难以获得。而实时荧光定量PCR 技术以其特异性强、所需组织少(活检组织，脱落细胞等)、定量、敏感、方 便等优点已得到全世界的公认，广泛用于肿瘤相关基因、病原体等诸多临床检 测。用定量RT-PCR法检测药物敏感相关基因来预测药物疗效是必然趋势，而成熟、标准的试剂盒是定量PCR成功检测的关键。目前荧光实时定量PCR所 使用的荧光化学方法主要有染料法(SYBRGreenI染料)和探针法。其中SYBR Green I染料法不需要设计合成序列特异性探针，而且熔点曲线来分析产物的 均一性有助于更准确地分析和识别扩增产物和引物二聚体，是一种简便，性价 比较高的实时监测方法。
技术实现思路
本技术的目的是为克服定量PCR探针法技术需要设计合成序列特异 性探针，检测成本高的不足之处，采用SYBR Green I染料定量PCR技术，提 供一种核糖核苷酸还原酶M1基因检测试剂盒。本技术由盒体、衬垫，染料法(SYBR Green I染料)PCR反应液、 Taq酶、标准品、阴性对照、阳性对照组成，衬垫上设有容器孔，分别染料法 (SYBR Green I染料)PCR反应液、Taq酶、标准品、阴性对照、阳性对照。其中PCR反应液的成份包含PCR缓冲液、SYBR Green I染料、MgCl2、 dNTPs、检测用引物。检测用引物有两对检测基因，RRM1;管家基因3-磷酸甘油醛脱氢酶 (GAPDH )。其中RRM1引物RRM1-F ACCTGGAGCCTTGGCATTTAGAC RRM1-R TACAACTTTGCGGACACGACCTTGAPDH引物GAPDH-F GAAGGTGAAGGTCGGAGTC GAPDH-R GAAGATGGTGATGGGATTTCRRM1标准品序列为acc tggagccttg gcatttagac atctttgaat tccttgattt aaagaagaac acaggaaagg aagagcagcg tgccagagat cttttctttg ctctttggat tccggatctc ttcatgaaac gagtggagac taatcaggac tggtctttga tgtgtccaaa tgagtgtcct ggtctggatg鄉tttgggg agaggaattt gagaaactat atgcaagtta tgagaaacaa ggtcgtgtcc gcaasgttgt aGAPDH标准品序列为gaa ggtgaaggtc ggagtc咖g gatttggtcg tattgggcgc ctggtcacca gggctgcttt taactctggt aaagtggata ttgttgccat caatgacccc ttcattgacc tcaactacat ggtttacatg ttccaatatg attccaccca tggcaaattc catggcaccg tcaaggctga gaacgggaag cttgtcatca atggaaatcc catcaccatc ttc对照品分为阳性对照和阴性对照，阴性对照为无RRMl表达的cDNA样本， 阳性对照为有RRMl表达的cDNA样本。本试剂盒保存于-4°C，尽量减少反复冻融。本技术主要用于在化疗前通过检测肿瘤组织中RRM1表达的水平来预测 患者对吉西他滨抗癌药的敏感性，从而指导临床化疗方案的选择，有利于患者 进行个体化治疗。本技术建立了利用SYBR Green I荧光染料PCR技术检测RRM1表达的方 法，并经检测患者标本证实该方法切实可行。SYBR Green I是一种结合于小沟 中的双链DNA结合染料，检测灵敏度很高。但是，由于SYBR Green I与所有的 双链DNA相结合，因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起 的假阳性会影响定量的精确性。在本检测项目中，通过优化引物和SYBR Green IPCR反应液，避免了非特异性的扩增，通过溶解曲线分析确定这种定量方法 不仅保持了PCR的高灵敏性，而且使得被检测基因的特异性大大提高。与探针 法相比较，方便且便宜。本试剂盒使用方法每次检测均应设立阳性和阴性对照。标准品用无菌去离子水稀释为1X108 一lX10'2拷贝/ml。扩增检测在荧光定量PCR仪上进行，总体积50ul,其中47.5ul PCR反应 液，2.0ul检测样品(逆转录产物、标准品、阳性和阴性对照)，0.5ulTaqDNA 聚合酶。反应条件50°C 2分钟，95°C 10分钟，95°C 15秒、60°C 1分钟共 40个循环，72'C10分钟。溶解曲线分析扩增产物确定无非特异性扩增，根据 所获得的标准曲线，分别计算标本中RRM1和GAPDH的量(拷贝/ul)。 RRM1 与GAPDH的比值即为RRM1表达指数。本技术具有的特点是探针法和SYBR Green I荧光染料法是实时定 量PCR中的常用方法，本技术通过优化PCR的引物、SYBRGreenI荧光 染料和PCR的条件，避免了 SYBR Green I荧光染料的缺陷，非特异性的扩增， 通过溶解曲线分析该试剂盒不仅保持了 PCR的高灵敏性，而且使得被检测基 因的特异性大大提高。本技术设计合理，与现有探针法相比较，不需要设 计荧光探针，使用方便而且成本低。附图说明图1为本技术试剂盒结构示本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种核糖核苷酸还原酶Ｍ１基因检测试剂盒，由盒体（１）、衬垫（２），染料法ＰＣＲ反应液（３）、Ｔａｑ酶（４）、标准品（５）、阴性对照（６）、阳性对照（７）组成，衬垫（２）上设有容器孔，分别放置染料法ＰＣＲ反应液（３）、Ｔａｑ酶（４）、标准品（５）、阴性对照（６）、阳性对照（７）。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：苏丹，马胜林，
申请(专利权)人：浙江省肿瘤医院，
类型：实用新型
国别省市：86[中国|杭州]