一种睾丸酮丛毛单胞菌工程菌制造技术

本发明专利技术通过ＤＮＡ重组技术对睾丸酮丛毛单胞菌进行定向调控，从而获得高表达３α－ＨＳＤ酶的睾丸酮丛毛单胞菌工程菌ＡＭＰ８（ＣＧＭＣＣＮｏ．２３６５），本发明专利技术的工程菌ＡＭＰ８（ＣＧＭＣＣ　Ｎｏ．２３６５）可作为天然３ａ－ＨＳＤ酶发酵生产的菌种，在不同培养条件下均能提高３ａ－ＨＳＤ酶的表达量，可以解决３α－ＨＳＤ酶得率低下的问题，对降低医疗成本，解决３α－ＨＳＤ酶依赖进口的现状具有很强的现实意义。

【技术实现步骤摘要】
专利说明一种睾丸酮丛毛单胞菌工程菌 所属
本专利技术涉及一种微生物菌株，特别是一种睾丸酮丛毛单胞菌工程菌菌株。
技术介绍
胆汁酸(bile acid)是一类结构相似化合物的统称。根据来源上分类可分为初级胆汁酸和次级胆汁酸两大类。初级胆汁酸是由肝细胞以胆固醇为原料直接合成，包括胆酸和鹅脱氧胆酸。初级胆汁酸在肠道中受细菌作用生成的胆汁酸，称为次级胆汁酸(secondary bile acid)，包括脱氧胆酸和石胆酸。大部分进入肠内的初级和次级胆汁酸可以被小肠和大肠分别吸收。由于胆汁酸的主要代谢过程是由肝脏完成的，因此肝功能的异常会影响胆汁酸的代谢。现代临床研究表明，以末梢血管中血液胆汁酸的浓度变化作为衡量肝功能的一个指标是非常可靠的。早期胆汁酸的测定方法主要包括气相色谱法、高效液相色谱法和放射免疫法等。由于这些方法测定所需样品量大，测定时间长，使临床应用受到了限制。为此，近年来人们提出了以酶促反应测定胆汁酸的方法，拟解决以上测定方法中存在的问题。 睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)是一种革兰氏阴性菌，类固醇诱导下会诱导表达多种羟类固醇脱氢酶，其中之一为3α-羟类固醇脱氢酶(3α-hydroxysteroid dehydrogenase，简称3α-HSD)。睾丸酮丛毛单胞菌3α-HSD酶可作用于多种类固醇基质，可逆地催化C19-27的类固醇3位羟基/酮基的氧化还原反应。医学上，用3α-HSD酶进行血液中总胆汁酸(total bile acid，TBA)的测定。3α-HSD酶主要有两个来源，一是通过基因工程技术在大肠杆菌中表达重组3α-HSD酶，二是直接从睾丸酮丛毛单胞菌中提取天然3α-HSD酶。重组3α-HSD酶由于酶活性低下，因此将其应用于TBA临床测定还未见报道。因此，目前TBA测定中所用的工具酶3α-HSD均是从睾丸酮丛毛单胞菌中直接提取而来的。然而，自然条件下睾丸酮丛毛单胞菌3α-HSD酶的表达量低，在经多步层析和制备性凝胶电泳技术纯化后，酶得率低下，这使得直接从细菌中分离的天然3α-HSD酶价格昂贵，在一定程度上限制了TBA测定的临床推广。 因此，应用生物技术手段对细菌进行定向调控，提高睾丸酮丛毛单胞菌3α-HSD酶的表达量，势必可以解决3α-HSD酶得率低下的问题，对降低医疗成本，解决3α-HSD酶依赖进口的现状具有很强的现实意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于应用DNA重组技术对睾丸酮从毛单胞菌进行定向调控，构建高表达3α-HSD酶的睾丸酮丛毛单胞菌工程菌。 本专利技术的一种睾丸酮丛毛单胞菌工程菌(Comamonas testosteroniAMP8，简称工程菌AMP8)，已于2008年1月25日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.2365。保藏单位的地址北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所。工程菌AMP8(CGMCC No.2365)的菌体呈杆状，大小为0.8μm×1.5μm，革兰氏染色阴性，偏端丛生鞭毛，运动。 工程菌AMP8(CGMCC No.2365)是应用DNA重组技术将含tac强启动子的pK18载体整合到睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroniATCC11996，简称C.test)的teiR基因上游表达调控区，筛选获得的高效表达3α-HSD酶的菌株。 本专利技术的工程菌AMP8(CGMCC No.2365)，其特征在于 ①基因组DNA中具有tac启动子，其序列为序列表中SEQ ID NO1中所示的碱基序列； ②基因组DNA中具有pK18序列，该序列为序列表中SEQ ID NO2中所示的碱基序列。 ③具有卡那霉素抗性。 所述的tac启动子指Amann et al.构建的启动子，pK18质粒指Pridmore构建的质粒载体，均由市场购得。 本专利技术的工程菌AMP8(CGMCC No.2365)的构建方法如下 ①C.test teiR基因的克隆； ②含有tac强启动子的同源重组基因打靶载体pKtac2-teiR的构建； ③同源重组基因打靶载体电穿孔转化细菌C.test； ④工程菌AMP8(CGMCC No.2365)的Southern blot筛选验证； ⑤不同培养条件下工程菌AMP8(CGMCC No.2365)的3α-HSD酶表达； ⑥工程菌AMP8(CGMCC No.2365)的3α-HSD酶表达稳定性检测。 本专利技术的工程菌AMP8(CGMCC No.2365)的培养方法如下将工程菌AMP8(CGMCC No.2365)接种于添加了60μg/mL氨苄青霉素和30μg/mL卡那霉素的LB或M8培养基中，进行摇床振荡培养，转速为180r/min，培养温度30℃，培养8～12小时。 所述LB培养基为常用培养基，可在市场购得。 所述的M8无机盐培养基的配制方法如下取12.8g Na2HPO4.7H2O，3g KH2PO4，2.5g NaCl，5.0g NH4Cl，2mL 1M MgSO4，0.1mL 1M CaCl2，0.2g Yeast Extact，加蒸馏水至1L，用NaOH或HCl调节pH值至7.0，120℃条件下灭菌18分钟，冷却后4℃保存备用。 本专利技术的工程菌AMP8(CGMCC No.2365)在不同培养条件下均能提高3a-HSD酶的表达量。如表1所示，工程菌AMP8(CGMCC No.2365)的3a-HSD酶表达量最高可达野生型菌株3a-HSD酶表达量的20倍，最低可达1.2倍，增加的幅度在1.2-20倍之间。本专利技术的工程菌AMP8(CGMCC No.2365)可作为天然3a-HSD酶发酵生产的菌种，可以解决3α-HSD酶得率低下的问题，对降低医疗成本，解决3α-HSD酶依赖进口的现状具有很强的现实意义。 表1 工程菌AMP8与野生型菌株不同培养条件下3a-HSD酶表达量检测 附图说明 图1.pKtac2-teiR的Xba I和Kpn I酶切验证图谱。其中M为DNA marker，1为pKtac2-teiR双酶切电泳条带。 图2.AMP8(CGMCC No.2365)的southern blot检测。其中1为野生型睾丸酮丛毛单胞菌C.test，2为睾丸酮丛毛单胞菌工程菌AMP8(CGMCCNo.2365)，3为阳性对照pKtac2，4为ddH2O。 图3.AMP8(CGMCC No.2365)与野生型菌株C.test在不同培养条件下3α-HSD酶蛋白的表达量检测。其中横坐标1为LB培养基，2为含0.27mg/L睾丸酮的LB培养基，3为含0.2mg/L胆固醇的LB培养基，4为含5g/L醋酸盐的M8培养基，5为含0.27mg/L睾丸酮的M8培养基，6为含0.2mg/L胆固醇的M8培养基。纵坐标为3α-HSD酶蛋白在细菌总蛋白中的含量(单位μg·mg-1)。 图4.AMP8的稳定性检测。其中纵坐标为3α-HSD酶蛋白在细菌总蛋白中的含量(单位μg·mg-1)，横坐标数值为培养的天数。 具体实施例 为了充分公开本专利技术的一种睾丸酮丛毛单胞菌工程菌，以下结合实施例加以说明。 实施例一、一种睾丸酮丛毛单胞菌工程菌的构建方法 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种睾丸酮丛毛单胞菌工程菌，其特征在于该菌为睾丸酮丛毛单胞菌工程菌（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ　ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ　ＡＭＰ８）ＣＧＭＣＣ　Ｎｏ．２３６５。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：潘大仁，陈建秋，周以飞，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：35[中国|福建]