本发明专利技术涉及的是人ＡＲＭＥＴ蛋白单克隆抗体制备方法及检测试剂盒，用限制性内切酶（ＮｃｏＩ／ＸｈｏＩ）将人ＡＲＭＥＴ蛋白的ｃＤＮＡ编码序列克隆到ｐＥＴ２８ａ（＋）载体上，表达Ｃ端融合６个组氨酸的重组ＡＲＭＥＴ蛋白；将ｐＥＴ２８ａ（＋）－ＡＲＭＥＴ质粒转化感受态细胞ＢＬ２１，诱导表达ＡＲＭＥＴ蛋白，收集菌体，纯化人ＡＲＭＥＴ蛋白；同时制备了抗ＡＲＭＥＴ的单克隆，建立了检测ＡＲＭＥＴ的试剂盒。本发明专利技术可用于对ＡＲＭＥＴ的功能研究、人体生理和病理机制的基础性研究；也可用于对临床疾病的辅助诊断。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及的是一种人体蛋白质ARMET (Arginine rich, mutated in early stage of tumors,亦称ARP、 MANF)的表达纯化、单克隆抗体制备及其检测的方法。
技术介绍
ARMET (Arginine rich, mutated in early stage of tumors)在公共数据库中也被 禾尔为 ARP(arginine-rich protein)或 MANF (mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor),其氨基酸序列见图1。最初的研究发现，该基因在早期肿瘤 中有单个核苷酸突变(Shridhar et al， 1996 a and 1996 b)，而随后的研究却发现， ARMET基因中出现的这种突变属于正常基因的多态性，而非肿瘤所特有(Evron et al., 1997; Tanaka et al.,2000)。这一研究结果使人们一度失去了对ARMET的研 究兴趣。但Petrova及同事在体外传代的大鼠中脑星形胶质细胞的培养液中分离 得到的神经营养因子MANF，其人类的同类物就是ARMET (Petrova et al., 2003)， 分子量在20kD左右。他们的研究并发现，重组的人ARMET可选择性地作用于 体外培养的多巴胺能神经元，促进其存活，在低剂量时作用优于神经营养因子 GDNF和BDNF(Petrova et al, J Mol Neurosci 2003 )。 2007年《Nature》上的 一篇报道格外引人注意，该研究发现，含保守序列的多巴胺能神经元营养因 子(Conserved Dopamine Neurotrophic Factor, CDNF)对多巴胺能神经元有保 护作用(Paivi Lindholm et al， Nature 2007)。而CDNF是ARMET (MANF)的 同类物，都属于含8个半胱氨酸保守序列的蛋白家属，且ARMET与CDNF的 氨基酸同源性为59%。到目前为止，与ARMET相关的报道不超过10篇，其中早期的(90年代中 期)4篇是关于它在早期肿瘤中的单基因突变；2篇有关于它与内质网应激的关 系；2篇有关对多巴胺能神经元影响的报道(J Mol Neurosci 2003; Neuroreport 2006);还有1篇报道是关于它的类似物CDNF对中脑多巴胺能神经元的保护作 用(Nature 2007)。对ARMET的研究目前世界范围内仅限于几个实验室，其功能目前还不清楚。对它的研究目前没有广泛开展的原因与缺乏检测它的方法有 关，因为到目前为止还没有市售的商品化的ARMET蛋白及相关抗体。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种人ARMET蛋白抗体制备方法及检测试剂盒，用于 ARMET蛋白的检测。本专利技术的的技术方案如下人ARMET蛋白抗体制备方法，包括以下步骤(1) 、 ARMET基因克隆、蛋白的诱导表达与纯化用限制性内切酶(Ncol/Xhol)将人ARMET蛋白的cDNA编码序列克隆到 pET28a(+)载体上，表达C端融合6个组氨酸的重组ARMET蛋白；将pET28a (+ ) -ARMET质粒转化感受态细胞BL21，诱导表达ARMET蛋白，收集菌体， 纯化人ARMET蛋白；(2) 、 Anti-ARMET单克隆抗体的制备用纯化的人ARMET蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠，通过杂交瘤细胞融合方 法制备Anti-ARMET单克隆抗体，选择滴度高的杂交瘤细胞进行扩增、冻存， 并注入BALB/c小鼠腹腔生产腹水型抗体；(3) 、抗体的纯化 采用辛酸-硫酸铵沉淀法及亲和层析法纯化单克隆抗体。 所述的人A脂ET蛋白抗体制备方法，包括以下歩骤其特征在于(1) 、所述的ARMET基因克隆、蛋白的诱导表达与纯化是指用限制性内切酶(NcoI/Xho1 )将人ARMET的cDNA编码序列克隆到pET28a(+) 载体上，表达C端融合6个组氨酸的重组ARMET蛋白；将pET28a( + )-ARMET 质粒转化感受态细胞BL21，置37'C培养箱过夜，以体积比1:100的比例，接种 于新鲜的含卡那霉素的LB培养基中扩大培养，37。C振荡培养至菌液A綱为0.6 0.8，加入IPTG诱导表达2-4小时；收集菌体并裂解，取上清液，加入到己预装 好的Ni-beads柱中，用含50mmol/L imidazole的缓冲液洗去非特异结合的蛋白， 再用组份为50腿ol/L NaH2P04 pH8.0、 300謹ol/L NaCI、 250mmol/L imidazole 的洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，并将洗脱的蛋白分装保存在-8(TC冰箱；(2) 、所述的Anti-ARMET单克隆抗体的制备是指① SP2/0细胞的处理复苏冻存的SP2/0细胞，状态稳定后用8-AG进行筛 选，继续培养，待细胞长至将70-80%融合时，收集细胞，用无血清的DMEM悬 浮，注射于BALB/c小鼠皮下，待长出实体瘤后，分离培养SP/20细胞，备用；② 免疫方案将纯化的人ARMET蛋白作为抗原液与等体积的弗氏完全佐剂充 分乳化，制成油包水抗原乳剂；将此乳剂于雌性BALB/c小鼠背部多点皮下注 射，200)ag/只；IO天后再用该抗原加等体积弗氏不完全佐剂腹部多点皮下注射， 200ng/只；10天后将纯化的抗原液200吗直接注射小鼠腹腔；剪鼠尾取血，用 酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清抗体效价，滴度较高者备用，融合前三天 尾静脉注射抗原液200pg/只；③ 细胞融合冲击免疫后第3天，无菌取脾制备脾细胞悬液；将Sp2/0骨 髓瘤细胞和免疫小鼠脾细胞(l X 108个细胞)混合，加入0.8 mL 50%PEG4000助融；融合2分钟后，缓慢加入不完全培养基，离心，用含 20X胎牛血清的HAT培养液重悬，加入饲养细胞，分在96孔板上；37°C C02 培养箱中培养；④ 克隆转移和检测融合后每天仔细观察，挑出单克隆，做好标记，待单 克隆的孔长至覆盖2/3孔时用ELISA筛选，选取滴度较高的单克隆孔，在显微 镜下定位，将单个克隆细胞移入含有HT培养液的24孔中，用移液器吹打分散 均匀；⑤ 选择抗体滴度高的选择滴度高的单克隆抗体进行扩增、冻存或制备腹水 型抗体。一种检测人ARMET蛋白的ELISA试剂盒，其特征在于该试剂盒组成为(1) 、包被抗体采用一株杂交瘤细胞产生的抗体；(2) 、固相支持物采用微孔板，用于包被抗原；(3) 、酶标抗体用辣根过氧化物酶标记的不同杂交瘤细胞株产生的单克隆 抗体(IgG或IgM);(4) 、阳性对照血清或阴性对照血清；(5) 、酶标抗体稀释液PBS;(6) 、底物溶液A液:O.O簡B， 0. 01MpH4. 5拧檬酸缓冲液;B液0. 08%过氧化脲，0. 1M柠檬酸-0. 2M磷酸氢二钠(pH5. 0)缓冲液；(7) 、洗涤液PBS，含O. 01%吐温-20;(8) 、终止液2M硫酸。本专利技术可既可用于对ARMET的功能研究、人体生理和病理机制的基础性探讨 研究，也可用于对临床疾病的辅助诊断，具有广泛的应用价值。 附图说明图l.ARMET的氨基酸序列 图2. ARME本文档来自技高网...
【技术保护点】
人ＡＲＭＥＴ蛋白单克隆抗体制备方法，包括以下步骤： （１）、ＡＲＭＥＴ基因克隆、蛋白的诱导表达与纯化 用限制性内切酶（ＮｃｏＩ／ＸｈｏＩ）将人ＡＲＭＥＴ蛋白的ｃＤＮＡ编码序列克隆到ｐＥＴ２８ａ（＋）载体上，表达Ｃ端融合６个组氨酸 的重组ＡＲＭＥＴ蛋白；将ｐＥＴ２８ａ（＋）－ＡＲＭＥＴ质粒转化感受态细胞ＢＬ２１，诱导表达ＡＲＭＥＴ蛋白，收集菌体，纯化人ＡＲＭＥＴ蛋白； （２）、Ａｎｔｉ－ＡＲＭＥＴ单克隆抗体的制备 用纯化的人ＡＲＭＥＴ蛋白作为抗原免疫ＢＡＬ Ｂ／ｃ小鼠，通过杂交瘤细胞融合方法制备Ａｎｔｉ－ＡＲＭＥＴ单克隆抗体，选择滴度高的单克隆杂交瘤细胞株进行扩增、冻存，并注入ＢＡＬＢ／ｃ小鼠腹腔生产腹水型抗体； （３）、抗体的纯化 采用辛酸－硫酸铵沉淀法及亲和层析法纯化单克隆抗体 。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：沈玉先，方圣云，王法财，余永强，王海萍，孙爱民，沈玉君，黄学桂，张晶晶，
申请(专利权)人：安徽医科大学，
类型：发明
国别省市：34[中国|安徽]
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