开发了一种使用黄病毒成员特异性免疫试剂的竞争性酶联免疫吸附测定（Ｃ－ＥＬＩＳＡ），以检测表明暴露于黄病毒的黄病毒成员特异性抗体。该测试是基于在黄病毒阳性血清存在下，对使用抗黄病毒ＩｇＡ捕获的黄病毒被膜蛋白上表位结合的竞争作用。该测试与病毒中和测试（ＶＮＴ）具有相当的灵敏度、特异性和速度。Ｃ－ＥＬＩＳＡ是一种用途广泛的技术，其可具有多种应用。将该实验步骤稍加改变可以得到基于Ｃ－ＥＬＩＳＡ的继发感染检测方法或者可用于血清型特异性的血清流行病学研究和／或疫苗评价的方法。所述针对Ｃ－ＥＬＩＳＡ开发的操作方法已通过使用登革热裂解物抗原和登革热特异性单克隆抗体得到验证。该测定可用于其它黄病毒，对日本脑炎（Ｊａｐａｎｅｓｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）病毒的测定结果举例说明了这点。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术特别地涉及检测人和/或动物对黄病毒或其等价物的暴露的 技术。更特别地，本专利技术涉及对取自对象(动物或人)的生物样品进行 快速简便的分析，从而确定该对象先前是否暴露于黄病毒科的成员或其 等价物。本专利技术还提供了基于血清分析而对黄病毒暴露进行血清分型， 并提供了针对黄病毒成员或其等价物感染的医学诊断试剂盒以及鉴别 性血清评价。本专利技术对于检测黄病毒继发感染、确定先前感染的血清分 型、血清流行病学和疫苗评价尤为重要。
技术介绍
黄病毒科(Flavividae )包括许多导致人类疾病并且通常经蚊和蜱传 播的病毒。黄病毒属(Flavivirus genus )包括多种病毒，其包括导致相 应疾病的黄热病病毒(yellow fever virus, YF )、登革热病毒、西尼罗 河(West-Nile, WN )和日本脑炎(Japanese enc印halitis， JE)病毒。登革热是世界上最常见和广泛的节肢动物传播的黄病毒感染，每年 有超过120万例登革热感染发生，另外有25亿生活在世界上登革热流 行区的人有患此病的风险(WHO/TDR, 2005年4月)。登革热病毒包 括4种不同的病毒血清型，其中每种都能产生多种迹象和症状，并且4种血清型中其一的原发感染会导致对该血清型的持久免疫。然而，仍存 在对不同血清型的继发感染机会。尽管登革热是大多数热带和亚热带国家的地方性疾病，然而它主要 发生在缺少卫生保健基础设施或财力而不能有效及时地诊断登革热的 发展中国家。在新加坡，这两种媒介物(vector)的不均匀分布导致人 口中不均匀的登革热传播(Ooi等，2001 )。通过血清学调查，发现易 感登革热的地区可能已发生变化。这一发现可有助于修正针对新的传播 区域的媒介物控制计划(vector control program )。但是，到目前为止 只完成了 4项血清流行病学的调查。造成进行的调查如此少的原因是实 验室检测的高额花费或所需试剂的缺乏。传统上，使用血凝抑制(hemagglutination inhibition, HAI)来检测 针对登革热的抗体。但是，该方法需要小鼠脑源性抗原，由于这样的细 胞难于培养使得所述抗原不易获取。另一常用方法是补体结合，但其需 要生命期短的抗体。越来越多的实验室采用商品化的酶联免疫吸附测定 (ELISA)试剂盒。然而，这些测试都不是特异性针对登革热抗体的， 它们与同一地区共同流行的其它黄病毒成员(如日本脑炎、西尼罗河、 丙型肝炎、黄热病、墨累山谷脑炎病毒等)发生交叉反应。最近，已对6种市售免疫测定系统用于检测血清中登革热病毒特异 性免疫球蛋白M (IgM)和IgG抗体(Goren等，2000 )的灵敏度进行 了评估。所评估的登革热病毒特异性测定针对IgM的灵敏度为71°/。 ~ 100 % ，针对IgG的灵敏度为52 % ~ 100 % ,其特异性分别为86 % ~ 96 %以及81% ~100o/。。这些测试的总测试时间为7~480分钟。此外，除 Pan-bioRIT以外，所有测试都需要实验室设备来支持，而Pan-bio RIT 对于登革热IgG测定的灵敏度和特异性非常低(分别为75%和52% )。 然而，这些研究中所评估的测试均不能检测登革热特异性抗体，而是与 其它黄病毒发生交叉反应。因此，目前检测早期继发感染还非常困难， 因为只有在急性感染期(发热)出现登革热特异性IgG才表明是继发登 革热感染(Schilling等，2004)。血清流行病学研究表明，通过抗体依赖性综合征增强(antibody dependent syndrome enhancement, ADE )，继发感染是引起登革出血热 和登革休克综合征的主要风险因素(Halstead等，1973, Halstead S.B.， 1988)。对于流行病学和病理学研究而言，区分原发和继发病毒感染以 及确定过去与当前感染的登革热血清型是很重要的。最广泛使用的登革热诊断技术是对可疑样品的血清学分析。但是， 该技术相当复杂，其原因如下(i)由于缺乏交叉保护的中和抗体，患 者可能具有4种登革热病毒血清型的多重和连续感染；(ii)在两种或更 多种黄病毒共同流行的地区，由于预先存在的抗体和原始抗原原罪性影 响(antigenic sin )(许多对首次黄病毒感染应答的B细胞克隆在之后的 每一次黄病毒感染中受到再次刺激而合成早期抗体，这些抗体与首次感 染病毒的亲和力较之与当次感染病毒的亲和力更高)的存在，多重和连续的黄病毒感染使鉴别诊断难于进行；(m)igG抗体对同源和异源的黄病毒抗原具有高水平的交叉反应性；以及(iv)在许多登革热继发感染 患者中，由于IgG抗体的长期存在(>10个月，如通过E/M-特异性捕 获IgG ELISA ( E/M-specific capture IgG ELISA )测量的；或终生，如 通过E/M-抗原包被的间接IgG ELISA测量的)，难于对过去、近来和 当前的登革热病毒感染进行血清学诊断(Gubler,D. J. 1996和Innis等， 1989 )o因此，在那些可以通过血清学进行诊断的病毒感染中，登革热病毒 感染是最具有挑战性的一种。但是，由于开发了针对不同结构和非结构 (nonstructural, NS )蛋白的用于登革热病毒感染血清诊断和血清流行 病学研究的多种方法，对分析复杂的病毒抗原和抗体应答近来取得了很 大的进展。传统上，使用血凝抑制来区分原发和继发登革热感染。由于该测试 存在固有缺陷，目前已不常用(Innis等，1989和Shu等，2003 )。相反 地，由于高灵敏度和特异性，捕获IgM和IgGELISA已成为区分原发 和继发感染最有效的方法(Innis等，1989, 1997)。但是，对于登革热感 染的血清分型、特别是血清流行病学研究来说，由于在登革热血清型抗 体中存在交叉中和抗体，因而捕获IgM ELISA和IgG ELISA均不可用。病毒中和测试(VNT)是目前可用的区分登革热和其它黄病毒的黄 金标准技术(WHO手册2002 )。 VNT也用于区别登革热的血清型(1-4 血清型)。针对任一种病毒得到的血清抗体可以中和所有登革热血清型 甚至其它黄病毒，但是较之中和异源病毒来说，其以更高的效价中和同 源病毒(Makino等，1994)。遗憾的是，在感染早期产生的抗登革热抗 体(IgM)引起对所有登革热血清型的同等水平的中和；因此，该阶段 的继发感染不能用VNT来测定(Nawa等，2000)。另一方面，VNT具 有如下缺点i. 需要精密的细胞培养实验室和训练有素的人员；ii. 测试持续对间超过一周；iii. 由于登革热的交叉反应抗体所致，来自登革热感染少于6个月的 患者的血清不能进行血清分型；iv. 难于检测多种登革热血清型；v. 10 %血清对细胞培养物有毒性作用。Innis等(1989 )首先提出通过测定登革热病毒IgM抗体单位与登 革热病毒IgG抗体单位的比值来区别原发和继发感染。他们指出，原发 登革热病毒感染患者的急性期血清具有较高的IgM/IgG比值，而继发感染的患者具有较低的IgM/IgG比值。该方法对于分析登革热患者的免疫 状况有很大帮助。最近本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于检测对象对黄病毒或其等价物的暴露的方法，所述方法包括如下步骤： 将来自所述对象的生物样品与抗黄病毒ＩｇＡ捕获的黄病毒组分混合物进行接触； 用竞争性黄病毒特异性免疫试剂处理所述生物样品和抗黄病毒ＩｇＡ捕获的组分；以及 在所述竞争性黄病毒特异性免疫试剂存在下，测定所述生物样品中存在的黄病毒特异性结合伴侣与抗黄病毒ＩｇＡ捕获的黄病毒组分之间所形成的复合物的存在情况。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：比容库马尔西，切尼诗祯李，
申请(专利权)人：国家环境局，
类型：发明
国别省市：SG[新加坡]
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