本发明专利技术提供从血清中早期检测胃癌、判断预后及分期的方法，通过以下方案实现：（１）用表面加强激光解吸电离－飞行时间质谱（ＳＥＬＤＩ）仪测定肿瘤患者与健康人血清标本的蛋白质组图谱；（２）结合生物信息学的方法筛选出相应的肿瘤标志物并建立检测模型进行分析检测。本发明专利技术方法不仅提供了用于方便、高效检测胃癌的血清蛋白质谱，提高人群中筛选胃癌的效率，节约医疗成本。同时对于一些确诊胃癌的患者，该发明专利技术提供了一个鉴别预后差、分期晚的血清学方法，可用于指导患者治疗。同时该发明专利技术提供了一些标记物用于进一步研究。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属恶性肿瘤检测方法，涉及、预后判断及分期的方法，为一种新的 非侵入性的检测方法，用于检测胃癌、判断预后不良与进展期胃癌，同时也提 供了一系列的候选肿瘤标志物用于进一步研究。
技术介绍
胃癌作为全球最常见的第二大恶性肿瘤，仍是癌症死亡的重要原因。在我国胃癌的发病率约为20/10万，死亡率在我国居癌症死亡率的第2位,而就诊患者 中多属中晚期，预后差。据统计,根治性手术治疗早期、进展期胃癌的5年生存 率分别为90%、 40%，所以只有早期发现、早期诊断、早期治疗才能使更多的 胃癌患者受益。目前我国早期胃癌发现率约10%，故进行大规模人群的筛查不仅 效率低下，而且浪费国家宝贵的卫生资源。大多数胃癌患者多伴有非特异性上 消化道不适症状，故对有症状的人群进行大规模筛查才能提高胃癌的检出率， 提高筛査效率。然而有研究提示即使在日本其早期胃癌发现率在40%，仅少部 分为利用纤维胃镜和放射学检査的大规模筛选时发现，故需要新的适用于大规 模筛选的非侵入性检测方法用于胃癌检测。而对于己确诊胃癌的患者，TNM分 期是目前临床用于指导治疗和预后判断的重要指标，但同一分期胃癌患者却会 出现不同预后，故如何从一些分期较早的胃癌中筛选出预后不良患者可以进行 强化术后治疗以提高生存期，而从进展期胃癌中筛选出预后良好患者可以避免 过度治疗是目前胃癌治疗中的难点。目前胃癌最常用的血清肿瘤标记物主要有CEA、 CA19-9、 CA72-4等，在 胃癌血清的表达阳性率介于16%-75%之间，而在判断预后方面它们的敏感性更 是低于40%。这些常用标志物存在灵敏度和特异度难以统一、约登指数(Youden，sIndex， YI， YI=灵敏度+特异度一1)小等问题，难以成为理想的 肿瘤标记物而用于临床检测或大规模人群筛查。这一现状给肿瘤的早期分子检 测、疗效及预后评价、复发及转移监测和生物治疗等方面造成了一定的困难。胃癌的发生、发展大多经历胃炎伴黏膜不典型增生、早期胃癌、进展期胃 癌乃至转移的过程，是内外病因交互作用的结果。涉及了多基因及其表达蛋白产物的改变，而蛋白质改变为功能变化的最终形式，蛋白质动态分析更能反映 疾病发生和发展。蛋白质组学的主要任务便是识别鉴定机体全部蛋白质，分析 其功能及其模式，同时反映恶性肿瘤在疾病发生发展过程中细胞内部的遗传特 性和当时环境的影响，以及直接在蛋白水平的表达分析。以往蛋白质组学研究主要依赖双向电泳技术(Two Dimensional Electrophoresis,2DE)，检测的蛋白质 数目比估计的细胞内总蛋白少，而一般的2DE能分辨1000 3000个蛋白质点， 对细胞内低拷贝蛋白、极端酸性或碱性蛋白、分子量过大或过小蛋白、难溶蛋 白(包括膜蛋白)等的电泳分离和检测仍面临很大困难。而蛋白芯片及其分析技 术的出现，克服了2DE存在的内在问题，可直接从未预处理样品或微量样本中 检测生物标志物--蛋白质质谱，为快速、简便、易行和高通量分析比较提供可 能。表面加强激光解吸电离-飞行时间质谱(Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization-Time of Flight-Mass Spectrometry SELDI-TOF-MS )技术是最近几年才发展起来的一种新的蛋白质组学研究方法，其根本的原理是通过 使用特异的探针表面俘获蛋白质来增强亲合力。SELDI蛋白质芯片技术的优势 在于1.可以分析2DE无法分析的蛋白质，包括疏水性蛋白质，等电点(pl)值过 高或过低的蛋白质，以及低分子量(〈25kD)的蛋白质；2.可分析未经处理的样品 中许多被掩盖的低浓度蛋白质，增加了发现疾病标志物的机会；3.被测样品无 需使用液相色谱或气相色谱预先纯化，故适用于分析组分复杂的生物样品；4. 所需样品量少，检测耗时短，且实验重复性好。这些优势使SELDI蛋白质芯片 技术特别适于筛选肿瘤标志物。蛋白质只要与SELDI蛋白质芯片结合，就可通 过质谱仪按蛋白质质量、电荷比(m/z)的不同及量的多寡用位置、强弱不同的 峰直观的表现出来，进而形成相应图谱，用于分析、判别。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供，具体通 过以下步骤实现1. 用表面加强激光解吸电离-飞行时间质谱(SELDI)仪测定胃癌患者与胃 炎患者血清标本的蛋白质组图谱；2. 结合生物信息学方法筛选出相应的肿瘤标志物并建立检测模型进行分 析检测。本专利技术采用强阴离子交换表面(SAX)芯片检测胃癌的蛋白质质谱。 本专利技术采用支持向量机(Support Vector Machine SVM)结合留一法验证筛4选肿瘤标志物并建立检测模型，进行判别分析。检测胃癌的肿瘤标记物由6个蛋白质质荷比峰组成3957 w/z， 4474 m/z, 4158 m/z, 8938 w/z, 3941 m/z和4988 m/z。检测预后不良胃癌的肿瘤标记物由5个蛋白质质荷比峰组成4474 m/z, 4542 m/z, 6443 m/z, 4988 w/z和6685 m/z。检测进展期胃癌的肿瘤标记物由6个蛋白质质荷比峰组成4474 m/z, 4060 m/z, 3957 m/z， 9446 m/z, 4988 m/z和5075 w/z。本专利技术方法克服了以往蛋白质组学研究主要依赖双向电泳技术存在的内 在问题，可直接从未预处理样品或微量样本中检测胃癌生物标志物--蛋白质质 谱，直接在蛋白水平迸行表达分析及高通量分析比较，为临床检测提供了快速、 简便、易行的高效检测胃癌的血清蛋白质谱方法，可提高人群中筛选胃癌的效 率，节约医疗成本。同时对于一些确诊胃癌的患者，该专利技术提供了一个鉴别预 后差、分期晚的血清学方法，可用于指导患者治疗。同时该专利技术提供了一些标 记物用于进一步研究。 附图说明图l为检测胃癌与胃炎的6个蛋白质峰质荷比峰分布图。图2为检测预后良好胃癌与预后不良胃癌的5个蛋白质峰质荷比峰分布图。图3为检测I/II期胃癌与III/IV期胃癌的6个蛋白质峰质荷比峰分布图。 图4为胃癌血清蛋白指纹图模型与CEA的ROC比较。 具体实施例方式本专利技术结合附图和具体实施例作进一步说明，这些实例仅用于说明目的， 而不用于限制本专利技术范围。实施例一本专利技术的检测方法 1、血清样本准备(1) 所有血清样品在冰浴中解冻30-60分钟后离心5分钟,取10ul血清与 20ul变性缓冲液U9 (9MUrea，2%CHARPS,50mMTris-HClPH9)充分混匀， 在冰浴中振荡30分钟；(2) 小心取出SAX芯片做好标记，装入生物芯片处理器，每孔加入200ul SAX结合缓冲液震荡2次预处理芯片；(3) 取其中10ul样品与110ulSAX结合缓冲液(50mMTris-HClpH9)溶液 中快速混匀，避免气泡产生,每孔加入处理好的血清样品100ul， 4。C震荡60分钟；(4) 血清样品后每孔加入200ulSAX结合缓冲液，室温下震荡2次,再加 入200ul去离子水清洗芯片2次；(5) 取出芯片，待微干后每孔加入0.5ulSPA，待微干后重复l次；(6) 上5禾几检领lj，用Ciphergen ProteinChip Software 3.2 (美国Ciphergen) 软件收本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测胃癌预后与分期血清蛋白质的方法，通过以下步骤实现： （１）用表面加强激光解吸电离－飞行时间质谱仪测定胃癌患者与胃炎患者血清标本的蛋白质组图谱，采用强阴离子交换表面芯片检测胃癌的蛋白质质谱； （２）结合生物信息学方法筛选出 相应的肿瘤标志物并建立检测模型进行分析检测，采用支持向量机结合留一法验证筛选肿瘤标志物并建立检测蛋白质指纹图谱模型，进行判别分析， 检测胃癌的肿瘤标记物由６个蛋白质质荷比峰组成：３９５７ｍ／ｚ，４４７４ｍ／ｚ，４１５８ｍ／ｚ，８９３８ ｍ／ｚ，３９４１ｍ／ｚ和４９８８ｍ／ｚ， 检测预后不良胃癌的肿瘤标记物由５个蛋白质质荷比峰组成：４４７４ｍ／ｚ，４５４２ｍ／ｚ，６４４３ｍ／ｚ，４９８８ｍ／ｚ和６６８５ｍ／ｚ， 检测进展期胃癌的肿瘤标记物由６个蛋白质质荷比峰组成 ：４４７４ｍ／ｚ，４０６０ｍ／ｚ，３９５７ｍ／ｚ，９４４６ｍ／ｚ，４９８８ｍ／ｚ和５０７５ｍ／ｚ。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：黄建，邱福铭，余捷凯，金祁峰，郑树，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]
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