一种将功能分子修饰到聚丁二炔纳米人工生物膜囊的方法技术

本发明专利技术属于人工生物膜领域。本发明专利技术涉及一种将功能分子修饰到聚丁二炔纳米人工生物膜囊的方法。本发明专利技术还涉及识别结合功能分子人工添加疏水尾端的一般思路、类生物膜聚丁二炔纳米囊泡功能化修饰的方法以及具有识别结合功能的聚丁二炔纳米人工生物膜囊在生物化学过程研究、临床检验诊断以及活性药物筛选中的应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于人工生物膜领域。本专利技术涉及一种将功能分子修饰到聚丁二炔纳米人工生物 膜囊的方法。本专利技术还涉及识别结合功能分子人工添加疏水尾端的一般思路、类生物膜聚丁 二炔纳米囊泡功能化修饰的方法以及具有识别结合功能的聚丁二炔纳米人工生物膜囊在生物 化学过程研究、临床检验诊断以及活性药物筛选中的应用。
技术介绍
含有丁二炔结构的类脂在形成高度有序而紧密的排列以后，在254nm的紫外光照射下可 以聚合形成蓝色的聚丁二炔结构。这种聚丁二炔结构随着所处环境的温度、溶剂、pH及其受 到的机械应力的改变，其颜色会发生相应的变化。1993年D.H.Charych等人在Science上发 表了一篇关于利用功能化聚丁二炔变色薄膜可以识别感冒病毒的文章，他们利用10，12-二十 五垸基二炔酸(PCDA)为基脂，唾液酸化的PCDA为受体分子，制备功能化LB膜，这种薄 膜呈现蓝色。当唾液酸遇到信息源感冒病毒时，引起聚丁二炔结构的电子态和重量的改变， 最终导致信息处理部分(聚丁二炔结构)的颜色由蓝变红，这种现象肉眼明显可见。根据 D.H.Charych等人的报道，这种变色是可以定量的，即所结合的感冒病毒愈多，颜色愈深。在 D.H.Charych等人使用的方法中，薄膜的功能化是通过化学方法实现的。首先唾液酸(受体) 分子与基脂PCDA化学偶联，然后这种唾液酸化的PCDA再与基脂PCDA—起进行聚合，进 而实现薄膜的功能化。这种功能化方法就决定了受体分子必须接在基脂PCDA的极性头上， 通过共价键与基脂一同形成一个大的聚合物分子，才能实现薄膜的功能化，而且受体化的 PCDA分子的合成过程复杂、耗时，因此原料不易得到。这些因素都严重地制约着这种方法 的广泛应用。为了避免这种复杂、成本高的化学修饰，有人提出了通过物理力(非共价键形式)将功能 分子引入聚丁二炔纳米囊泡，实现其功能化组装。这样既克服了化学方法功能化组装存在的 缺点，又保留了聚丁二炔纳米颗粒具有一步比色检测生物活性分子的优点。在此基础上，我们进一步提出一种新的将功能分子修饰到聚丁二炔纳米人工生物膜囊表面的方法，我们利用 简单化学合成或基因工程的方法为功能分子添加一段跨膜蛋白作为疏水尾端，可以使其通过 疏水相互作用修饰到聚丁二炔纳米人工生物膜囊表面。这种方法更具有普遍适用性，避免了 复杂的化学合成，降低了应用的成本。采用这种方法几乎可以将所有形式的功能分子，包括 糖脂、糖蛋白、多肽甚至核酸分子修饰到聚丁二炔纳米人工生物膜囊表面。采用这种方法修 饰的聚丁二炔纳米人工生物膜囊可以应用于临床检验、检验检疫以及生物化学过程研究。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新的将功能分子修饰到聚丁二炔纳米人工生物膜囊表面的方 法，其特征在于利用简单化学合成或基因工程的方法为功能分子添加一段跨膜蛋白作为疏水 尾端，可以使其通过疏水相互作用修饰到聚丁二炔纳米人工生物膜囊表面，构建成具有识别 功能的聚丁二炔纳米人工生物膜囊。本专利技术所述的简单化学合成指将识别功能分子(非蛋白质分子)利用共价键修饰到某种 跨膜蛋白的C端或N端，人工添加疏水尾端。这种识别功能分子(非蛋白分子)-跨膜蛋白组合体的结构组成为a. 识别功能分子-跨膜蛋白b. 跨膜蛋白-识别功能分子 本专利技术所述的基因工程方法指将识别功能分子(蛋白质分子)在一种跨膜蛋白的C端或N端融合制成双功能融合蛋白，人工添加疏水尾端。所述的识别功能分子(蛋白质分子)-跨 膜蛋白组合体是由识别功能分子和跨膜蛋白组成的双功能融合蛋白，其N端或C端还可以分 别融合具有帮助蛋白质纯化或折叠作用的融合蛋白或短肽标签、或者N端和C端同时融合具 有帮助蛋白质纯化或折叠作用的融合蛋白或短肽标签，其结构组成为a. 识别功能分子-跨膜蛋白b. 跨膜蛋白-识别功能分子c. A-识别功能分子-跨膜蛋白d. A-识别功能分子-跨膜蛋白-Be. A-跨膜蛋白-识别功能分子f. 跨膜蛋白-识别功能分子-Bg. 识别功能分子-跨膜蛋白-Bh. A-跨膜蛋白-识别功能分子-B其中，A肽、B肽分别为常见的融合蛋白或短肽标签，如大肠杆菌硫氧还原蛋白、谷胱 甘肽-S-转移酶、聚组氨酸短肽标签、Flag标签；识别功能分子指特异性蛋白受体、蛋白酶或 抗体分子。与巳有的化学修饰或物理修饰方法相比，本专利技术的特色、创新在于利用简单化 学合成或基因工程的方法为功能分子添加一段跨膜蛋白作为疏水尾端，这种方法具有普遍适 用性。对于非蛋白形式的识别功能分子，利用跨膜蛋白N端的-NH2基团、C端的-COOH基 团进行简单化学修饰就可以将识别功能分子与跨膜蛋白相连；对于蛋白形式的识别功能分子，采用了目前相当成熟的重组DNA技术，利用重叠拼接延伸PCR的方法将编码蛋白功能分子 的基因和编码跨膜蛋白的基因融合构建成融合基因，克隆至常用的表达质粒载体中，在目前 常用的基因工程表达体系中进行表达和分离纯化。 附图说明图h功能化修饰的聚丁二炔纳米人工生物膜囊示意图。 具体实施例方式以下通过实施例进一步描述本专利技术，而非限制本专利技术。 实施例l具有识别沙门菌功能的聚丁二炔纳米人工生物膜囊的制备方法1. scFvLH-pVin融合基因的克隆及其表达载体的构建①设计引物VL上游5，-CGCCTCGAG CAAATCGTGGTTACTCAAG-3，引入酶切位点 VL下游5'-AGAGCCACCTCCGCC TGAACCGCCTCCACC CTTAGGTTGCCCGAG隱3' VH上游5，-GGCGGAGGTGGCTCT GGCGGTGGCGGATCG GAAGTTCAAGTCCAGCAGAG-3' VH下游a5，-CTTAGCCGACGAGACAGT-3'VH下游b5，-AGAGCCACCTCCGCC TGAACCGCCTCCACC CTTAGCCGACGAGACAGT-3'pVIII上游5，-GGCGGAGGTGGCTCT GGCGGTGGCGGATCG GCTGAGGGTGACGAT-3' pVIII下游5'-ATGGTACCC7M GCTTGCTTTGCTGGT-3，引入酶切位点。② 分别用VL上下游引物和VH上游引物和VH下游引物a分别扩增pMD-18T-VLcDNA 和pMD-18T-VLcDNA，经琼脂糖电泳确认PCR产物，行切胶回收DNA片段。③ 将回收的VL VH PCR扩增产物等摩尔浓度混合，以VL上游引物和VH下游引物a经 重叠延伸拼接PCR方法将VH、 VL cDNA拼接成5'-VL-Linker-VH-3，片段，即scFv LH (fl)， 并将其克隆到pMD-18T载体中。重叠延伸拼接PCR条件为94°C 5分钟；94°C 30秒，52°C 30 秒，72。C30秒，4-5个循环；94'C30秒，60。C30秒，72。C30秒，4-5循环；94。C30秒， 63。C30秒，72。C30秒，20个循环；72。C10分钟，4'C保存。 .用pVIII上下游引物扩增pMD-18T-pVIII质粒，经琼脂糖电泳确认PCR产物，行切胶 回收DNA片段。⑤.用VL上游引物和VH下游引物b扩增pMD-18T-scFvLH，经琼脂糖电泳确认PCR产 物，行切胶回收DNA片段。(D.将回收的scFv片段和pVIII片段等摩本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种将功能分子修饰到聚丁二炔纳米人工生物膜囊的方法，其特征在于利用简单化学合成或基因工程的方法为功能分子添加一段跨膜蛋白作为疏水尾端，可以使其通过疏水相互作用修饰到类生物聚丁二炔纳米囊泡表面，构建成具有识别功能的聚丁二炔纳米人工生物膜囊。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：吕建新，
申请(专利权)人：温州医学院，
类型：发明
国别省市：33[中国|浙江]