本发明专利技术涉及一种新的纳米金复合底物ＮＣＳ的制备方法及用途。纳米金复合底物ＮＣＳ是由一分子Ｎａｎｏｇｏｌｄ－ＮＨＳ的ＮＨＳ基团与一分子３，３’，４，４’－四氨基联苯（ＤＡＢ）的其中一个氨基反应形成酰胺键而得到的化合物。其制备方法是将Ｎａｎｏｇｏｌｄ－ＮＨＳ与过量１０～２０倍的ＤＡＢ分别溶解后混合，室温避光反应３～５ｈ即可。产物采用Ｓｅｐｈａｄｅｘ－Ｇ２５凝胶色谱或Ａｍｉｃｏｎ Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ－３超滤离心管分离纯化。纳米金复合底物ＮＣＳ在ＨＲＰ催化下可导致大量纳米金颗粒直接沉积，从而可以应用于生物芯片等的高灵敏度检测，以及新型的纳米金免疫诊断试剂的研制。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种新的纳米金复合底物NCS的制备及其在分子检测等领域的 用途。
技术介绍
纳米余原指直径在l 100nm尺寸的微小金颗粒， 一般以分散在水中的溶胶 形式存在，因此通常称为胶体金。胶体金具有表面效应、小尺寸效应、宏观量子 隧道效应等独特的物理化学性质以及良好的生物相容性，非常适合于生物大分子 的标记和检测。胶体金用于生物检测的研究己有接近一个世纪的历史，上世纪八 十年代初免疫金银染色(immuno-gold-silver staining, IGSS)技术的出现是胶体金 应用于生物检测的里程碑。该技术首先用胶体金标记待检的抗体或抗原，然后在 体系中引入银离子。小尺寸效应使胶体金颗粒具有很强的催化还原作用，可以将周围的银离子还原成银颗粒；而这些银颗粒又可以进一歩催化还原周围的银离子。这种级联瀑布催化作用使得银颗粒越聚越多，紧紧包裹胶体金颗粒积聚成团状银壳，形成几乎肉眼可见的黑色颗粒，用普通电镜甚至肉眼即可观测。IGSS 的检测成本远低于荧光和化学发光检测，与色原检测相比又显著提高了灵敏度， 因此很快得到广泛应用。胶体金存在一些固有的缺点颗粒大小不一、易凝集、与生物分子以静电吸附结合，标记不稳定且假阳性率高等。为了克服这些缺点，近年来美国Nanoprobes 公司开发了一种新型的纳米金颗粒并命名为"Nanogold"，该颗粒是以一个包含 大约67个金原子的簇化物为核心的复合体，通过位于其表面的金原子与三芳基磷 配基或卤化物离子结合而形成稳定的纳米金分子，其中心粒径仅1.4nm，表面不 带电荷，在溶液中呈离散状态。这种新型的纳米金与胶体金相比有诸多优点① 颗粒小且均匀一致、标记密度高、穿透性好；②经特定基团修饰后可以与生物大 分子以共价键结合，使得标记分子高度稳定；③颗粒表面不带电荷，因此不易凝 集，适用于很宽的PH值范围和离子强度中，等等。由于Nanogold有如此多的优 点，因此一经出现便取代胶体金，迅速应用于原位杂交、免疫组化、Western等生物医学检测的众多领域。生物芯片包括基因芯片、蛋白芯片和组织芯片等，是一项集合了生命科学、 微电子学、物理学、化学和材料科学等众多学科的生物高新技术，是高效大规模 获取核酸、蛋白质等生物信息的重要手段，在基因表达谱研究、疾病分子检测和 大规模药物筛选等众多领域具有广阔的应用前景。荧光检测法是生物芯片的常规 检测方法，即将荧光色素化合物(如FITC、 Cy3、 Cy5等)直接或间接标记在待检 核酸或蛋白分子上，产生的荧光信号采用激光共聚焦扫描检测。该方法的最大缺 点是检测仪器价格昂贵，从而严重限制了生物芯片的推广应用，尤其是在中小医 疗机构的推广应用。为了解决这个问题，近几年已有研究小组将IGSS技术应用 于基因芯片和蛋白芯片的可视化检测，从而避免使用荧光扫描仪，大幅降低了检 测成本。其中基因芯片的金标银染检测方法己经获得国家专利(一种基因芯片的 纳米金标记银染检测法，ZL专利号02113147.3)。该方法的缺点是检测灵敏度 不高，不能完全满足疾病分子检测等领域的要求，尤其是对于待检样本中极少量 或单个细菌的检测，进一歩提高可视化检测的灵敏度是生物芯片推广应用中面临 的重要课题。本实验室一直致力于生物芯片检测新技术研究，为了提高可视化检测的灵敏 度，我们将免疫组化中广泛应用的TSA技术与IGSS相结合应用于生物芯片的检 湖'J。 TSA (tyramine signal amplification,酪胺信号放大)是由Bobrow等人于1989 年首次提出的。信号放大分子酪氨是--个酚基化合物，可以作为HRP的作用底 物。TSA的原理是在酶(HRP)催化下，大量连接半抗原的酪氨分子的沉积。以基 因芯片为例，TSA-IGSS的检测过程如下首先将点制了探针阵列的基因芯片与 待检核酸样本杂交，然后依次加入链酶亲合素标记的HRP、生物素标记的酪胺、 链酶亲合素标记的纳米金。每歩之间于37t!温育30 min，最后加入银增强试剂 显色。TSA-IGSS比IGSS的检测灵敏度提高了 10-100倍，目前已经申请专利(一 种基因芯片的TSA-纳米金标记银染检测法，专利申请号200610135832.X)。该 方法的缺点是检测过程相对比较繁琐，这是因为试验证明HRP无法直接催化 酪胺连接的纳米金反应沉积，而必须通过两歩反应才能导致纳米金沉积，即HRP 首先催化生物素化酪胺反应以及随后生物素与链酶亲合素-纳米金结合。因此 TSA-IGSS只能作为一种过渡检测手段，HRP直接催化纳米金沉积才是根本的解 决办法，而找到能导致纳米金直接沉积的新的HRP底物则是解决问题的关键。
技术实现思路
本专利技术的目的在于利用生物耦联技术，提供一种能使HRP直接催化纳米金 颗粒沉积、从而显著提高金银可视化检测灵敏度的纳米金复合底物NCS。 本专利技术的另一目的在于提供所述的纳米金复合底物NCS的制备方法。 本专利技术的另一目的在于提供所述的纳米金复合底物NCS在生物芯片、胶体 金等分子检测领域的用途。本专利技术的目的是通过如下的技术方案实现的。本专利技术提供一种能使HRP直接催化纳米金颗粒沉积的纳米金复合底物 NCS，该复合底物是由一分子Nanogold-NHS的NHS基团与一分子3,3',4,4，-四氨基联苯(DAB)的其中一个氨基反应形成酰胺键而得到的化合物。本专利技术提供一种所述的纳米金复合底物NCS的制备方法，包括如下步骤1) 制备取定量的Nanogold-NHS先用少量DMSO溶解，然后再加蒸馏水 混匀；取过量10 20倍的DAB用HEPES溶液溶解；将上述两溶液混合，室温 避光反应3 5h;期间不定时混合，使其充分反应。2) 纯化反应混合液釆用Sephadex-G25凝胶色谱柱过滤纯化，或者采用 Amicon Centricon-3超滤离心管分离纯化。NCS溶液置于4'C避光保存；保存超过三天以上，加0. 1%的BSA和0.05 ^的NaN3。本专利技术提供所述的纳米金复合底物NCS的用途。将NCS应用于基因芯片和 蛋白芯片的可视化检测，并比较与IGSS、 TSA-IGSS的检测灵敏度。胶体金免疫诊断试剂在结核、艾滋等重大传染病的诊断和辅助诊断中正日益 得到广泛应用，但缺点是假阴性率较高，从而影响了疾病的诊断和治疗。研制基 于NCS的新型纳米金免疫诊断试剂将可以大幅度提高检出率，具有广阔的发展 前景。本专利技术提供的纳米金复合底物NCS的优势之处在于HRP催化NCS反应可 以直接导致大量纳米金颗粒沉积，与IGSS和TSA-IGSS检测方法比较，应用该底物既可以实现生物芯片的高灵敏度可视化检测，又简化了操作歩骤。附图说明图1为纳米金复合底物NCS结构示意图。图2为分别采用IGSS、TSA-IGSS和NCS检测伤寒沙门氏菌的梯度扩增PCR 产物的检测灵敏度比较图。用于PCR扩增的伤寒菌模板浓度依次为105 CFU/mL、 104CFU/mL、 103CFU/mL、 102CFU/mL。图3为分别采用IGSS、 TSA-IGSS和NCS同时检测霍乱弧菌和痢疾杆菌的 梯度扩增PCR产物的检测灵敏度比较图，用于PCR扩增的霍乱弧菌和痢疾杆菌 的模板浓度依次为106CFU/mL、 105CFU/mL、 104本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种新的纳米金复合底物ＮＣＳ，是由一分子Ｎａｎｏｇｏｌｄ－ＮＨＳ的ＮＨＳ基团与一分子３，３’，４，４’－四氨基联苯（ＤＡＢ）的其中一个氨基反应形成酰胺键而得到的化合物。 ＊＊＊ 纳米金复合底物ＮＣＳ结构示意图。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈苏红，戚红卷，王升启，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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